Overview
Denne artikel beskriver DNA-ekstraktion fra zebrafisk hale klip. Protokollen demonstrerer en hurtig og effektiv metode til at analysere zebrafisk genotyper.
Protocol
1. DNA-forberedelse
- Forbered DNA lysis buffer: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Der tilsættes frisk Proteinase K til en endelig koncentration på 1 mg/ml på brugsdagen.
- Vævsindsamling:
- For voksne fisk fin klip:
- Bedøve fisk: Placer fisken i 0,004% MS-222 (tricain) opløsning. Vent til gill bevægelse bremser.
- Sæt fisk på en stak på 5-10 Kimwipes og skær et lille stykke halefinne, ca. 2-3 mm, med et sterilt barberblad.
- Placer hurtigt fisken i en mærket tank med ferskvand til genopretning; forsigtigt mærke både tanken og tilsvarende rør, der vil indeholde fin klip. Skift vandet og fodre fisken hver anden dag.
- Finclipsen op med en steril pipettespids, og overfør den til et rør fyldt med 100 μl DNA lysis buffer.
- Kassér pipettespidsen, og kassér barberbladet i en skarp beholder.
- For embryo hale klip:
- Placer embryoner i 0,004% MS-222 (tricain) opløsning. Vent 2 minutter.
- Skær et stykke hale med pincet under et dissekerende mikroskop.
- Sæt halen i et mærket rør fyldt med 30 μl DNA lysis buffer.
- Sæt hurtigt embryoet i et rør, der indeholder 100 μl 4% paraformaldehyd.
- Label rør med embryoner og deres tilsvarende hale rør.
- Rørene opbevares med embryoner ved 4 °C natten over til fiksering.
- Rengør tangen ved hjælp af Milli-Q vand og Kimwipes mellem hvert foster for at minimere forurening.
- For hele embryoner:
- Placer embryoner i 0,004% MS-222 (tricain) opløsning. Vent 2 minutter.
- Sæt 1-5 embryoner i et rør fyldt med 100 μl DNA lysis buffer. Dechorionation er ikke nødvendig.
- For voksne fisk fin klip:
- DNA-fordøjelse
Inkuber rør med væv (finne- eller haleklemmer eller embryoner) ved 55 °C i 4 timer i op til natten over. - Inaktiver Proteinase K
Varmerør til 95 °C i 15 min. DNA skal straks anvendes til PCR eller opbevares ved -20 °C i op til 3 måneder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
Tricaine | |||
Paraformaldehyde |