꼬리 클립에서 DNA 추출 : 제브라 피시 Genotyping에 사용되는 방법

Overview

이 문서에서는 제브라피시 꼬리 클립의 DNA 추출에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 제브라피시 유전자형을 분석하는 신속하고 효율적인 방법을 보여줍니다.

Protocol

1. DNA 준비

1. DNA 용해 완충제 준비: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.3% Tween 20, 0.3% NP40. 신선한 Proteinase K를 사용 당일 1 mg/ml의 최종 농도에 추가합니다.
2. 조직 수집:
   1. 성인 생선 지느러미 클립의 경우:
      1. 생선 마취: 물고기를 0.004% MS-222(트리카인) 용액에 놓습니다. 아가미 운동이 느려질 때까지 기다립니다.
      2. 5-10 김스 와이프의 스택에 물고기를 넣고 멸균 면도날로 약 2-3mm의 꼬리 지느러미를 잘라냅니다.
      3. 물고기를 담수가 있는 라벨탱크에 빠르게 놓아 복구합니다. 조심스럽게 지느러미 클립을 포함하는 탱크와 해당 튜브를 모두 레이블. 물을 변경하고 격일로 물고기를 공급합니다.
      4. 멸균 파이펫 팁으로 핀 클립을 들고 100 μl DNA 리시스 버퍼로 채워진 튜브로 옮길 수 있습니다.
      5. 파이펫 팁을 버리고 면도날을 날카로운 용기에 넣습니다.
   2. 배아 꼬리 클립의 경우:
      1. 배아를 0.004% MS-222(트리카인) 용액에 넣습니다. 2 분 기다립니다.
      2. 해부 현미경으로 집게로 꼬리 조각을 자른다.
      3. 30 μl DNA 리시스 버퍼로 채워진 라벨이 부착된 튜브에 꼬리를 넣습니다.
      4. 신속하게 100 μl 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 튜브에 배아를 넣어.
      5. 배아와 해당 테일 튜브를 가진 라벨 튜브.
      6. 고정을 위해 하룻밤 동안 배아로 튜브를 저장합니다.
      7. 오염을 최소화하기 위해 각 배아 사이에 밀리-Q 물과 킴 와이프를 사용하여 집게를 청소하십시오.
   3. 전체 배아의 경우:
      1. 배아를 0.004% MS-222(트리카인) 용액에 넣습니다. 2 분 기다립니다.
      2. 100 μl DNA 용해 완충제로 채워진 튜브에 1-5 개의 배아를 넣습니다. 반향은 필요하지 않습니다.
3. DNA 소화
   조직 (지느러미 또는 꼬리 클립 또는 배아)으로 튜브를 55 °C에서 4 시간 동안 하룻밤 동안 배양하십시오.
4. 단백질을 비활성화 한 단백질 Ae K
   15분 동안 95°C로 의한 열관은 즉시 PCR에 사용되거나 최대 3개월 동안 -20°C에 저장되어야 한다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde