Извлечение ДНК из хвоста клип: метод, используемый в Зебрафиш Genotyping

Overview

В этой статье описывается извлечение ДНК из клипа хвоста зебры. Протокол демонстрирует быстрый и эффективный метод анализа генотипов зебры.

Protocol

1. Подготовка ДНК

1. Подготовка буфера ДНК-лиза: 50 мМ ККл, 10 мм Трис-HCl рН 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Добавьте свежий протеиназы K к окончательной концентрации 1 мг/мл в день использования.
2. Коллекция тканей:
   1. Для взрослых рыбий плавник клип:
      1. Анестезия рыбы: Поместите рыбу в 0,004% MS-222 (трикаин) раствор. Подождите, пока движение жабры замедлится.
      2. Положите рыбу на стопку из 5-10 кимвипов и вырежьте небольшой кусочек хвостового плавника, около 2-3 мм, стерильным лезвием бритвы.
      3. Быстро поместите рыбу в помеченный бак с пресной водой для восстановления; тщательно обозначить как бак и соответствующую трубку, которая будет содержать плавник клип. Изменение воды и кормить рыбу через день.
      4. Возьмите плавник клип с стерильной наконечником пипетки и передать его в трубку, наполненную 100 йл ДНК лиза буфера.
      5. Отбросьте наконечник пипетки и выбросьте лезвие бритвы в контейнер с острыми.
   2. Для зажима хвоста эмбриона:
      1. Поместите эмбрионы в 0,004% раствор MS-222 (трикаин). Подождите 2 мин.
      2. Вырезать кусок хвоста с типсами под рассечением микроскопа.
      3. Положите хвост в помеченную трубку, наполненную буфером лиза ДНК 30 мл.
      4. Быстро поместите эмбрион в трубку, содержащую 100 мкл 4% параформальдегида.
      5. Этикетка труб с эмбрионами и их соответствующие хвостовые трубки.
      6. Храните трубки с эмбрионами при 4 градусов по Цельсию на ночь для фиксации.
      7. Очистите типсы, используя воду Милли-Зи и Кимвипес между каждым эмбрионом, чтобы свести к минимуму загрязнение.
   3. Для целых эмбрионов:
      1. Поместите эмбрионы в 0,004% раствор MS-222 (трикаин). Подождите 2 мин.
      2. Положите 1-5 эмбрионов в трубку, наполненную буфером лиза ДНК 100 мкл. Дехорионация не нужна.
3. Пищеварение ДНК
   Инкубировать трубки с тканью (плавник или хвост клипы или эмбрионы) при 55 градусов по Цельсию в течение 4 часов до ночи.
4. Инактивировать протеиназу K
   Нагрейте трубки до 95 градусов по Цельсию в течение 15 мин. ДНК следует использовать для ПЦР немедленно, или хранить при температуре -20 градусов по Цельсию в течение 3 месяцев.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde