Overview
Este artículo describe la extracción de ADN del clip de cola de pez cebra. El protocolo demuestra un método rápido y eficiente para analizar los genotipos de pez cebra.
Protocol
1. Preparación del ADN
- Preparar el búfer de lisis de ADN: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.3% Tween 20, 0.3% NP40. Añadir proteinasa K fresca a una concentración final de 1 mg/ml el día de uso.
- Recolección de tejidos:
- Para clip de aleta de pescado para adultos:
- Anestesiizar peces: Coloque el pescado en solución 0.004% MS-222 (tricarina). Espere hasta que el movimiento de las branquias se ralentice.
- Ponga pescado en una pila de 5-10 Kimwipes y corte un pequeño trozo de la aleta de cola, de unos 2-3 mm, con una hoja de afeitar estéril.
- Coloque rápidamente el pescado en un tanque etiquetado con agua dulce para su recuperación; etiquete cuidadosamente tanto el tanque como el tubo correspondiente que contendrá el clip de aleta. Cambia el agua y alimenta a los peces cada dos días.
- Coja el clip de aleta con una punta de pipeta estéril y transfiéralo a un tubo lleno de 100 μl de tampón de lisis de ADN.
- Deseche la punta de la pipeta y deseche la cuchilla de afeitar en un recipiente afilado.
- Para clip de cola de embrión:
- Coloque los embriones en una solución 0,004% MS-222 (tricarina). Espera 2 min.
- Corta un trozo de cola con fórceps bajo un microscopio diseccionador.
- Coloque la cola en un tubo etiquetado lleno de 30 μl de tampón de lisis de ADN.
- Poner rápidamente el embrión en un tubo que contiene 100 μl 4% paraformaldehído.
- Etiqueta tubos con embriones y sus correspondientes tubos de cola.
- Almacene los tubos con embriones a 4 °C durante la noche para su fijación.
- Limpie los fórceps usando agua Milli-Q y Kimwipes entre cada embrión para minimizar la contaminación.
- Para embriones enteros:
- Coloque los embriones en una solución 0,004% MS-222 (tricarina). Espera 2 min.
- Poner 1-5 embriones en un tubo lleno de 100 μl de tampón de lisis de ADN. La desconominación no es necesaria.
- Para clip de aleta de pescado para adultos:
- Digestión del ADN
Incubar tubos con tejido (clips de aleta o cola o embriones) a 55 °C durante 4 horas hasta la noche. - Inactivar la Proteinase K
Los tubos de calor a 95 °C durante 15 min. EL ADN debe utilizarse para PCR inmediatamente, o almacenarse a -20 °C durante un tiempo de hasta 3 meses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
Tricaine | |||
Paraformaldehyde |