Extração de DNA do clipe da cauda: um método usado em genotipagem de zebrafish

Overview

Este artigo descreve a extração de DNA do clipe da cauda de zebrafish. O protocolo demonstra um método rápido e eficiente para analisar genótipos de zebrafish.

Protocol

1. Preparação de DNA

1. Prepare o tampão de dna: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Adicione proteinase K fresco a uma concentração final de 1 mg/ml no dia do uso.
2. Coleta de tecidos:
   1. Para clipe de barbatana de peixe adulto:
      1. Anesthetize peixe: Coloque o peixe em solução 0,004% MS-222 (tricaine). Espere até que o movimento da brânquia diminua.
      2. Coloque peixe em uma pilha de 5-10 Kimwipes e corte um pequeno pedaço da barbatana de cauda, cerca de 2-3 mm, com uma lâmina de barbear estéril.
      3. Coloque rapidamente o peixe em um tanque rotulado com água doce para recuperação; rotule cuidadosamente o tanque e o tubo correspondente que conterá o clipe da barbatana. Troque a água e alimente os peixes dia sim, dia não.
      4. Pegue o clipe da barbatana com uma ponta de pipeta estéril e transfira-o para um tubo cheio de 100 μl de tampão de DNA.
      5. Descarte a ponta da pipeta e descarte a lâmina de barbear em um recipiente afiado.
   2. Para clipe de cauda de embrião:
      1. Coloque os embriões em solução 0,004% MS-222 (tricaine). Espere 2 min.
      2. Corte um pedaço de cauda com fórceps sob um microscópio dissecando.
      3. Coloque a cauda em um tubo rotulado cheio com 30 μl de tampão de dna lise.
      4. Coloque rapidamente o embrião em um tubo contendo 100 μl 4% de paraformaldeído.
      5. Rotular tubos com embriões e seus tubos traseiros correspondentes.
      6. Armazene os tubos com embriões a 4 °C durante a noite para fixação.
      7. Limpe os fórceps usando água Milli-Q e Kimwipes entre cada embrião para minimizar a contaminação.
   3. Para embriões inteiros:
      1. Coloque os embriões em solução 0,004% MS-222 (tricaine). Espere 2 min.
      2. Coloque 1-5 embriões em um tubo cheio com 100 μl de tampão de DNA. Descorionação não é necessária.
3. Digestão de DNA
   Incubar tubos com tecido (clipes de barbatana ou cauda ou embriões) a 55 °C por 4 horas até durante a noite.
4. Inativar o Proteinase K
   Tubos de calor a 95 °C por 15 min. O DNA deve ser usado imediatamente para PCR, ou armazenado a -20 °C por até 3 meses.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde