Summary
Een 3D-systeem van het kweken van menselijke articulaire chondrocyten in hoge mate van gewrichtsvocht wordt beschreven. Gewrichtsvocht geeft de meest natuurlijke micro-omgeving voor het kraakbeen, en kan gemakkelijk worden verkregen en opgeslagen. Dit systeem kan dus gebruikt worden voor het bestuderen van het herstel van kraakbeen en voor het screenen van geneesmiddelen voor de behandeling van artritis.
Abstract
Kraakbeendestructie is een centraal pathologisch kenmerk van artrose, een belangrijke oorzaak van invaliditeit in de VS. Kraakbeen in de volwassen niet zeer efficiënt regenereren in vivo, en als gevolg daarvan, artrose leidt tot een onomkeerbaar verlies van kraakbeen en wordt begeleid door chronische pijn en immobiliteit 1,2. Kraakbeen tissue engineering biedt veelbelovende mogelijkheden om zich te vernieuwen en te herstellen weefsel functie. Deze technologie houdt doorgaans zaaien chondrocyten in natuurlijke of synthetische steigers en het kweken van de daaruit voortvloeiende 3D in een evenwichtige medium te bouwen over een periode van tijd met een doel van techniek een biochemisch en biomechanisch volwassen weefsel dat kan tot een defect site getransplanteerd in vivo 3-6 . Het bereiken van een optimale conditie voor de chondrocyten groei en matrix depositie is essentieel voor het succes van het kraakbeen tissue engineering.
In de inheemse gewrichtsholte, kraakbeen bij de articheid oppervlak van het bot is badend in gewrichtsvloeistof. Deze duidelijke en viskeuze vloeistof levert voedingsstoffen aan het avasculaire kraakbeen en bevat groeifactoren, cytokines en enzymen die belangrijk zijn voor chondrocyten stofwisseling 7,8. Bovendien, gewrichtsvocht vergemakkelijkt lage wrijving beweging tussen kraakbeen vlakken vooral door afscheidende twee belangrijke componenten, hyaluronzuur en lubricin 9 10. In tegenstelling, is weefselmanipulatieproduct kraakbeen meestal gekweekt in kunstmatige media. Hoewel deze media zijn waarschijnlijk in staat om meer gedefinieerde voorwaarden voor het bestuderen van chondrocyte stofwisseling te bieden, gewrichtsvocht het meest nauwkeurig weerspiegelt de natuurlijke omgeving van die articulaire chondrocyten wonen inch
Inderdaad, gewrichtsvocht heeft het voordeel dat het gemakkelijk te verkrijgen en op te slaan, en kunnen vaak regelmatig worden aangevuld door het lichaam. Verschillende groepen hebben het kweekmedium aangevuld met gewrichtsvocht in het kweken van menselijke, rund, konijn en hond chondrocytes, maar meestal alleen gebruikt lage niveaus van gewrichtsvloeistof (minder dan 20%) 11-25. Terwijl de kip, paard en menselijke chondrocyten werden gekweekt in het medium met een hoger percentage van de synoviale vloeistof, deze cultuur systemen waren twee-dimensionale 26-28. Hier presenteren we onze manier van kweken van menselijke articulaire chondrocyten in een 3D-systeem met een hoog percentage van de gewrichtsvloeistof (tot 100%) over een periode van 21 dagen. Daarbij hebben we een belangrijke hindernis overwonnen door de hoge viscositeit van de gewrichtsvloeistof. Dit systeem biedt de mogelijkheid van een studie van de menselijke chondrocyten in synoviaal vocht in een 3D-omgeving, die verder kan worden gecombineerd met twee andere belangrijke factoren (zuurstofspanning en mechanische belasting) 29,30, dat de natuurlijke omgeving vormen voor het kraakbeen aan het natuurlijke milieu na te bootsen voor kraakbeen groei. Bovendien kan dit systeem ook worden gebruikt voor het testen van gewrichtsvloeistof activiteit op chondrocyten en bieden een platform voor het ontwikkelen vanherstel van kraakbeen technologieën en therapeutische opties voor artritis.
Protocol
Een 3D-systeem voor het kweken van menselijke articulaire chondrocyten in gewrichtsvloeistof
In dit werk hebben we ingekapseld menselijke articulaire chondrocyten in alginaat kralen met behulp van een aangepaste productie-stelde voor inkapseling protocol (Lonza, en 31). Met behulp van deze 3D-constructies, hebben we een systeem ontwikkeld voor het kweken van cellen in een kweekmedium met uiteenlopende percentages van de menselijke gewrichtsvloeistof en hebben tevens deze 3D-constructen voor kraakbeen genexpressie.
1. Bereid menselijke articulaire chondrocyten (HAC) voor drie-dimensionale (3D) het inkapselen
- Dooi een injectieflacon (1 ml) van de menselijke articulaire chondrocyten (HAC) (Lonza) (Passage 2) in 37 ° C waterbad gedurende 1 minuut.
- Meng met 1 ml van chondrocyten groei media (Lonza) en gecentrifugeerd bij 3000 rpm gedurende 3-5 minuten om de cellen te verzamelen. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer celpellet in chondrocyten groei media (Lonza).
- Plaat cellen in een 10 cm weefselcultuur plaat (BD Biosciences), en cultuur in chondrocyten groei media (Lonza) tot de cellen confluent. HACs moet worden gebruikt bij een passage nummer niet hoger dan 3 of 4 (P3 of P4).
- Was HACs op de plaat met 155mm NaCl in plaats van de standaard PBS, gevolgd door trypsinzation aan cellen voor alginaat kraal inkapseling te verzamelen. Zodra cellen zijn vrijstaand, spin down de cellen op 3000rpm voor 5min. De cellen zijn nu klaar voor 3D-inkapseling.
2. Kapselen HACs in 3D kralen
Resuspendeer de HACs in 1,2% alginaat-oplossing (Sigma) met een dichtheid van 8x10 5 cellen / ml. Cel aantallen werden voorafgaand aan de inkapseling bepaald, met behulp van een standaard mobiele teller. Het is heel belangrijk om goed te mengen tot een gelijkmatige verdeling van de cellen in de kralen te verzekeren.
- Pipetteer de HAC / alginaat-oplossing mengsel in een 12 ml spuit bevestigd aan een 22-gauge naald (Tyco Healthcare, Inc.)
- Ondertussen bereiden een 50 mL bekerglas met 102 mM CaCl 2 bij een volume 5 maal die van de HAC / aginate oplossing. Plaats een roerstaafje in het bekerglas en roer langzaam de 102 mM CaCl 2-oplossing (op ca. 150 tpm).
- Houd de spuit ongeveer 6 centimeter boven het oppervlak van de CaCl 2-oplossing en voeg de HAC / alginaat mengsel in de CaCl 2-oplossing druppelsgewijs. In het algemeen, de resulterende alginaat kralen zijn 2mm in diameter met een inkapseling dichtheid van ongeveer 10 4 cellen / kraal. Opmerking: De hoogte van de spuit over de CaCl 2-oplossing is belangrijk. Kortere afstand zal resulteren in tear-drop in plaats vorm van sferische vorm van kralen, waardoor ongelijke mechanische integriteit en cel-inkapseling.
- Laat de kralen roer de CaCl 2-oplossing gedurende 20-25 minuten. Terwijl andere alginaat inkapseling protocollen wijzen op een veel kortere incubatietijd van 10 minuten vonden we dat langere incubatietijd met de CaCl 2-oplossing de integriteit van de worden verbeterdadvertenties.
- Verwijder de CaCl 2-oplossing, was de kralen 2-3 keer in 2-3 volumes van NaCl, en dan eens in de chondrocyten differentiatie medium (Lonza). Terwijl andere alginaat bead inkapseling protocollen betrekking hebben op het gebruik van een filter voor de bovenstaande wassen procedures, vonden we dat de alginaat kralen worden vaak gevangen in het filter en uitdrogen, waardoor de efficiëntie van de inkapseling. We vonden het meest efficiënte om de kralen naar de bodem van de beker af te wikkelen voordat gooi de oplossing.
- Gebruik een standaard spatel om de kralen te zetten in de cultuur gerechten. We meestal cultuur 12 korrels per 3 cm goed voor 2 dagen in chondrocyten groeimedium om chondrocyten naar de inkapseling proces aan te passen op de middellange ze werden gekweekt in voordat u tot chondrocyten differentiatie medium (Lonza) met gewrichtsvocht.
3. Cultuur chondrocyten in gewrichtsvloeistof kweekmedium
- Verse gewrichtsvocht kan worden verkregen bij een outpatient kliniek (We verkregen synoviavocht van Tufts Medical Center). Het gewrichtsvocht kan worden overgedragen in 15 ml falcon buisjes naar het laboratorium, en onmiddellijk gecentrifugeerd bij 3000 rpm voor 15 min tot cel vuil te verwijderen. Aliquot celvrije synoviale vloeistof in 1,5 ml microcentrifuge buizen, om te voorkomen dat herhaaldelijk bevriezen en ontdooien. Supernatant kan worden opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik.
- Voorafgaand aan het kweken, meng de synoviale vloeistof met chondrocyten differentiatie medium (CDM, Lonza) op verschillende volumetrische verhoudingen, met een constante concentratie van 100mm ascorbinezuur en 9 mM CaCl 2 (dit spoor hoeveelheid CaCl 2 is om te zorgen voor de integriteit van de alginaat kralen).
- Houd de plaat op een rockend platform in een 37 ° C incubator (schommelen frequentie: ongeveer 75 keer / min) om de distributie te helpen voedingsstoffen binnen het alginaat kralen, en te verminderen klontering van de korrels. Dit is vooral belangrijk omdat we de cultuur van deze chondrocyten voor een langere periode (tot 4 weken). Noot: Terwijl de chondrocyten groei en differentiatie media (Lonza) bevatten twee meest gebruikte antibiotica gentamycine en amfotericine, hebben we niet een aanvulling op alle antibiotica, wanneer we gebruik van verschillende percentage van de gewrichtsvloeistof voor de chondrocyten kweken. Geen vervuiling was ooit is waargenomen.
- Verandering media mengsels om de 2-3 dagen. De viscositeit van de gewrichtsvloeistof is een belangrijke hindernis in het kweken van chondrocyten ingekapseld in alginaat kralen tijdens lange-termijn culturen. We vonden het meest effectief om gewrichtsvloeistof-medium aangevuld verdunnen met 102mm CaCl 2 (50% V / V), die versterkt ook de integriteit van de alginaat kralen. Op deze manier kan het medium langzaam worden verwijderd met een pipet, zonder beschadiging van de kralen.
4. Oogst HACs in alginaat kralen voor de analyse van genexpressie
Speciale aandacht moet worden genomen bij het oogsten van de HACs van de alginaat kralen voor genexpressie analyse.
- Was de alginaat kralen 3 times in 102 mM CaCl 2 voor ongeveer 5 minuten per keer.
- Haal de chondrocyten door de toevoeging van 55 mM NaCitrate op een volume 4-5 keer die van de kralen. Het is belangrijk dat de alginaat kralen volledig worden ondergedompeld in de NaCitrate oplossing. Schud of rock voor 20-30 minuten.
- Spin down van de cellen en gooi het supernatant.
- Voor de RT-PCR-analyse, resuspendeer de celpellet in cel lysis buffer (Qiagen RNA isolatie kit), en ga verder met RNA-zuivering.
5. Fix HACs in alginaat kralen voor histologische analyse
Speciale aandacht dient te worden genomen om de HACs oogst van de 3D kralen voor histologische analyse.
- Was de alginaat kralen 3 keer in 102 mM CaCl 2 voor ongeveer 5 minuten per keer. Om volledig wegspoelen de viskeuze synoviale vloeistof, vonden we het meest effectief om 's nachts wassen met chondrocyten differentiatie medium (Lonza), schommelen in een 37 ° C incubator (schommelen frequentie: ongeveer 75 keers / min). De chondrocyten groeimedium werd gebruikt om de chondrocyten te overleven in deze langdurige wassen te waarborgen en om een maximale penetratie van de vaststelling middel mogelijk te maken.
- Bevestig de kralen in 70% ethanol 's nachts, en ga verder met histologische analyse. Voor het uitvoeren van DAPI kleuring, incubeer alginaat kralen met DAPI oplossing (500ng/ml) voor 1 uur onder zachte wiegen, en was voor de 3 keer met 102mm CaCl 2 voor 15 minuten per keer. DAPI beelden kunnen dan worden bekeken onder een fluorescentiemicroscoop. De kralen kunnen ook coupes voor Alcian blauw en H & E kleuring.
6. Representatieve resultaten
Onze 3D-methode voor het kweken van menselijke chondrocyten in hoge percentages van gewrichtsvocht is afgebeeld in het schema weergegeven in figuur 1. Na het menselijke chondrocyten werden ingekapseld in alginaat kralen, werden zij kunnen groeien in medium aangevuld met verschillende verhoudingen van de gewrichtsvloeistof. Omwille van de viscositeit van het gewrichtsvocht, is het essentieel omcultuur chondrocyten onder constante rocken voorwaarden aan het klonteren van het kraakbeen constructies te voorkomen en een gelijkmatige verdeling van de voedingsstoffen te garanderen. Het is ook essentieel om uitgebreid te wassen het alginaat kralen voor het ophalen van de chondrocyten, zodat de vaststelling of de lysis buffer kan de kralen doordringen (Fig.1). Bright veld (BF) beelden van chondrocyten in de alginaat kralen worden weergegeven in figuur 2. DAPI kleuring werd uitgevoerd om usniform verdeling van de cellen binnen de kralen (afb. 2) te bevestigen. Aan het eind van de 21-dagen cultuur periode, werd de analyse van genexpressie uitgevoerd door qRT-PCR. De referentie-gen GAPDH werd gebruikt voor normalisatie voor alle PCR's, zoals het was vastbesloten om een van de meest betrouwbare referentie genen voor qPCR analyse op chondrocyten 32. Een voorbeeld hiervan is te zien in Fig. 3, waar we analyseerden de resultaten van menselijke articulaire chondrocyten gekweekt in gewrichtsvloeistof samengevoegd uit zes patiënten met artrose. In overeenstemming met het feit dat de chondrocyten van deLonza is uitgebreid in 2D culturen, die onvermijdelijk zou leiden tot de-differentiatie 33, vonden we dat Day 0 chondrocyten uitgedrukt minimale niveaus van kraakbeen matrix genen (afb. 3). 3D kweken van chondrocyten met chondrocyten differentiatie medium (Lonza) of medium aangevuld met gewrichtsvloeistof aanzienlijk meer kraakbeen genexpressie van collageen, aggrecan en MMP13, die chondrocyten re-differentiatie duidt op dag 21 (figuur 3) 34. Verhoging van het percentage van het gewrichtsvocht in de media heeft geleid tot een vergelijkbaar niveau van het kraakbeen matrix markers collageen II en aggrecan mRNA expressie (Fig.3A en 3B). Bovendien, chondrocyten gekweekt in 100% gewrichtsvloeistof zelfs vertoonden een daling van het kraakbeen afbrekend enzym MMP13 mRNA-expressie in vergelijking met die gekweekt in medium alleen (Fig.3C). Interessant is dat de expressie van celdood indicator caspase 3 geleidelijk af met toenemende verhoudingen van gewrichtsvocht, wat suggereert dat synovial vloeistof kweken heeft geleid tot een verminderde apoptose niveaus (fig. 3D). Daarom is onze resultaten laten zien dat het kweken van menselijke articulaire chondrocyten in hoge mate van synoviaal vocht in een 3D-omgeving is een haalbare technologie.
Tabellen en Figuren
Figuur 1. Schematische weergave van de methode om de menselijke cultuur articulaire chondrocyten in hoge percentages van gewrichtsvocht in 3D alginaat kralen. Eerst worden chondrocyten en alginaat-oplossing gemengd. Wanneer toegepast druppelsgewijs naar de CaCl 2-oplossing, worden chondrocyten geïmmobiliseerd binnen de verknoopte Ca-alginaat hydrogel kralen. Deze 3D-constructies worden vervolgens gekweekt in de chondrocyten differentiatie medium (Lonza) met verschillende verhoudingen van het menselijk gewrichtsvloeistof. Na 21 dagen van het kweken onder een rockende voorwaarde, zijn alginaat kralen bevattende cellen uitgebreid gewassen, waarna de cellen worden opgehaald voor gentherapieexpressie analyse.
Figuur 2. Bright veld (BF) en DAPI afbeeldingen van de menselijke articulaire chondrocyten ingekapseld culturen met 0%, 30%, 50%, 70% en 100% gewrichtsvocht. Chondrocyten zijn bolvormig in alle kweekomstandigheden. Beelden van heldere veld (BF) en DAPI waren bedekt om de locatie en de verdeling van chondrocyten te bevestigen. Inzetstukken, vergrote beelden. Pijlpunten, colocalization van chondrocyten in BF en DAPI kleuring beelden.
Figuur 3. QRT-PCR analyse van ingekapselde menselijke articulaire chondrocyten op dag 0 (D0), een na 21 dagen van het kweken van (D21) in medium aangevuld met verschillende verhoudingen van synoviaal vocht (SF) (0%, 30%, 50%, 70 % en 100%). Resultaten van vier onafhankelijke steekproeven worden hier weergegeven. GAPDH werd gebruikt als interne referentie voor alle PCR's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit rapport hebben we een methode ontwikkeld die voor de cultuur van de menselijke articulaire chondrocyten kan in een 3D omgeving in medium dat hoge concentraties van het menselijk synoviaal vocht bevat. Gewrichtsvocht is een van de belangrijkste componenten die de natuurlijke omgeving vormen in de gewrichtsholte, waar articulaire chondrocyten wonen. Echter, de viscositeit van de gewrichtsvloeistof is een grote uitdaging voor drie-dimensionale de lange termijn kweken van chondrocyten. Om het overwinnen van de uitdaging om zelfs voedingsstof distributie in een 3D-constructie in een viskeuze omgeving en om te voorkomen dat aggregatie, we kraakbeen bouwt onder constante beweging met zachte wiegen. Ter verhoging van de structurele integriteit van het kraakbeen constructen, we wijzigde de traditionele procedure van zaaien chondrocyten in een alginaat hydrogel met inbegrip van optimalisering van de lengte van de tijd voor kraal vorming en de media-veranderende procedure 31. Dergelijke procedures zijn essentieel bij hetkraakbeen constructen zijn behandeld in de viskeuze gewrichtsvloeistof tijdens langdurige culturen.
Wij geloven dat deze methode zal ons toelaten om de biologie van de menselijke articulaire chondrocyten in hun natuurlijke milleu, de synoviale vloeistof te bestuderen. Een mogelijke zorg is dat reagens diffusie misschien niet ideaal voor de chondrocyten ingekapseld in alginaat kralen en gekweekt in een viskeuze omgeving. Dus voor het bestuderen van het effect van bepaalde reagentia op engineered kraakbeen, kan beter diffusie worden bereikt door het verminderen van de grootte van de alginaat kralen, en met behulp van perfusie systemen om de distributie te vergemakkelijken reagens in gewrichtsvloeistof. Terwijl onze vertegenwoordiger resultaat werd verkregen door het kweken van normale menselijke chondrocyten in synoviaal vocht afkomstig van patiënten met artrose, geloven wij deze methode kan worden geëxtrapoleerd naar synoviale vloeistof gebruiken van een verder gezond persoon of een andere gezonde gewervelde dieren. Omdat gewrichtsvocht activiteit kan worden gecorreleerd aan de combinatorische activiteitenbanden van een groot aantal biochemische factoren aanwezig zijn in de vloeistof, kan het netto-effect van de synoviale vloeistof op chondrocyten genexpressie in ons systeem worden gecorreleerd met de ernst van de ziekte en zal uiteindelijk ons helpen om de intra-articulaire milieu te begrijpen voor en na de behandelingen. Bovendien kan onze methode ook leiden tot de mogelijkheid van het gebruik van een patiënt eigen gewrichtsvloeistof voor het kweken van autologe chondrocyten om gewrichtskraakbeen die individueel is afgestemd regenereren. Te dien einde, kan dit systeem geven inzicht in het bestuderen van de biomechanische krachten die door de gewrichtsvloeistof op engineered kraakbeen ook 35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura en Dana Cairns (Tufts University) te bedanken voor het verstrekken van hulp bij het gewrichtsvloeistof opslag en centrifugeren. Dit werk werd gefinancierd door de NIH (1R01AR059106-01A1) voor LZ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma-Aldrich | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | JT Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza Inc. | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza Inc. | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza Inc. | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta Biosciences | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco Healthcare, Covidien | 8881 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Platform rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Vari-mix | |
| Collagen IIa-forward | 5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’ | ||
| MMP13-forward | 5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’ | ||
| MMP13-reverse | 5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’ | ||
| Caspase 3-forward | 5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’ | ||
| Caspase 3-reverse | 5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’ | ||
References
- Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
- Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data. Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).
- Chung, C., Burdick, J. A.
- Glowacki, J.
- Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. 3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes. Tissue Eng. Part A. , (2009).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R.
- Zvaifler, N. J., Firestein, G. S.
- Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).
- Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression. Biochim. Biophys. Acta. , (2011).
- van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Biorheology. 37, 45-55 (2000).
- Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage. Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).
- Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro. Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis. Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid. Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).
- Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis. Agents Actions. 26, 193-195 (1989).
- Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes. Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).
- Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).
- Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs. Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).
- Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid. J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).
- Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro. Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).
- Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis. Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).
- Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).
- Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture. J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).
- Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture. Arthritis Rheum. , (2011).
- Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro. Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).
- van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).
- Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).
- Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD. Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).
- Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).
- Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).
- Toegel, S., Huang, W., Piana, C. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).
- Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).
- Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).
- Anat, J. 121, 107-118 (1976).
