Summary
Il modello di organismo
Abstract
Il modello di organismo geneticamente trattabili C. elegans ha fornito dei chiarimenti in una miriade di questioni biologiche, attivata per il suo tempo di generazione breve, la facilità di crescita e di piccole dimensioni. Questa piccola dimensione, però, è non riconosciute una serie di approcci tecnici che si trovano in altri sistemi modello. Ad esempio, le trasfusioni di sangue nei sistemi di mammiferi e le tecniche di innesto delle piante consentono domande di composizione del sistema circolatorio e di segnalazione. Il sistema circolatorio del worm, il pseudoceloma, finora è stato impossibile per il dosaggio direttamente. Per rispondere alle domande di segnalazione intercellulare e circolatorio sistema di composizione C. elegans ricercatori hanno tradizionalmente rivolto a un'analisi genetica, cellule / tessuti soccorso specifico e analisi mosaico. Queste tecniche forniscono un mezzo per inferire ciò che avviene tra le cellule, ma non sono universalmente applicabili identificazione e caratterizzazione di molecole extracellulari. Qui vi presentiamo una newly tecnica sviluppata per dosaggio direttamente il fluido pseudocoelomic di C. elegans. La tecnica inizia con uno manipolazione genetica o fisica per aumentare il volume di fluido extracellulare. Successivamente gli animali sono sottoposti ad una tecnica di microiniezione vampirica inversa usando un'attrezzatura microiniezione che permette il controllo della pressione ammenda equilibrio. Dopo l'isolamento del fluido extracellulare, il fluido raccolto può essere saggiata mediante trasferimento in altri animali o per mezzo molecolari. Per dimostrare l'efficacia di questa tecnica presentiamo un approccio dettagliato per analizzare un esempio specifico di molecole segnale extracellulari, dsRNA lungo durante una risposta sistemica RNAi. Anche se la caratterizzazione di RNAi sistemica è una prova di principio esempio, vediamo come questa tecnica adattabile a rispondere a una serie di domande di composizione del sistema circolatorio e di segnalazione.
Protocol
1. Preparazione dei materiali
Il materiale necessario per microiniezione inverso vampirica è simile a quella richiesta per microiniezione tecniche standard utilizzate per fare transgenico C. elegans ceppi 1. Sebbene alcuni reagenti (ad esempio piastre di saggio) sono realizzati il giorno del trasferimento sperimentale, molti dei materiali devono essere coordinately preparati su un periodo di 8 giorni (vedere Tabella 1 per una tabella di tempo). Come tale, è importante pianificare in anticipo attenzione quando si utilizza questa tecnica (per i reagenti e le apparecchiature necessarie vedi Tabella 2).
Iniezione pastiglie:
- Fare una soluzione al 2% di agarosio in H 2 O e calore fino a dissoluzione. Aliquotare 1 ml in aliquote in tubi microcentrifuga da 1,5 ml e conservare a 4 ° C.
- Disporre 22 x 50 mm su vetri di copertura di un banco con i bordi leggermente sporgente dal bordo superiore del banco per facilitare raccoglierle in fretta.
- PokEA piccolo foro nel coperchio della provetta (usare una puntina) per consentire lo sfiato. Porre il tubo in un becher da 15 mL con circa 5 ml di acqua, e microonde per fondere (circa 35 secondi).
- Usando una pipetta Pasteur e luogo bulbo una goccia (circa 35 mL) del fuso agarosio su un vetrino e mettere immediatamente un secondo bicchiere coperchio sopra la goccia ad un angolo di 90 ° rispetto al primo. Ripetere l'operazione per diversi vetri di copertura di altri.
- Dopo l'agarosio si è solidificato, rimuovere il vetro di copertura e consentire il pad asciugare completamente overnight (se necessario prima, i vetrini possono essere collocati in un forno a 50-80 ° C per 15-30 minuti).
- Pad possono essere memorizzate in una scatola di vetro di copertura a temperatura ambiente indefinitamente.
Dosaggio piastre:
Per saggiare la letalità embrionale associato pal-1 RNAi, la preparazione di piastre di saggio deve essere effettuato il giorno dell'esperimento vampirica. L'obiettivo è di ettarive un prato minima batterica pur non morire di fame i vostri vermi. Un prato troppo spesso fa segnare Pal-1 larve estremamente difficile in quanto i piccoli, gli animali deformi traslucide L1 può essere facilmente perso nel cibo. Piatto preparato deve essere ottimizzata per aver realizzato il fenotipo di interesse.
- Preparare OP50: 5 ml di semi di brodo LB con una singola colonia OP50 cresciute su piastre di agar LB. Incubare la OP50 a 37 ° C per una notte agitando, poi conservare a 4 ° C.
- Preparare 35 piatti NGM mm secondo protocollo di base (vedi nota 1).
- Spot 20 pl della notte OP50 cultura (passo 1,7) su ogni piatto NGM. Lasciare che il LB-OP50 ad asciugare (questo dovrebbe richiedere meno di 20 minuti).
Aghi di iniezione:
- Tirare aghi per iniezione di vetro borosilicato capillari con un P97 fiammeggiante / marrone micropipetta estrattore da strumenti Sutter (vedere la Figura 1 per la forma rappresentante ago).
- Negozio di iniezioneaghi in un porta-aghi costruito da una piastra di Petri e plastilina (vedi 1).
2. Preparazione di Worms
Il volume stimato pseudocoelomic di un adulto C. elegans è ermafrodita 40-80 picolitri (com pers. David Hall). Per ottenere campioni di fluido extracellulare da un piccolo serbatoio è utile per aumentare la risorsa totale disponibile. Abbiamo identificato tre metodi per aumentare notevolmente il fluido disponibile nei vermi donatori. Nostro metodo primario sfrutta il fenotipo di CLR-1 (e1745) mutanti, che può causare un aumento di 10 volte o più in volume del liquido extracellulare (Figura 2). I due metodi alternativi utilizzano il fatto che i conti germinali per circa un terzo del volume totale del verme, e la sua rimozione dal GLP-1 (RNAi) o risultati ablazione laser in animali con fluido pseudocoelomic riempire il vuoto germinale (Figura 2) 2 </ Sup>.
Preparazione di vermi donatori con clr-1 (e1745)
Vedere la Figura 3 per clr-1 (e1745) analisi del flusso di lavoro di trasferimento
- Streak i batteri che esprimono dsRNA per singole colonie su piastre di LB + 25μg/mL carbenicillina. Useremo pal-1 dsRNA batteri che producono per questa dimostrazione. Incubare per una notte a 37 ° C.
- Da una striato LB + 25 mg / ml piastra carbenicillina di pal-1 (RNAi) batteri, scegliere una singola colonia per inoculare una cultura 3 ml pernottamento in LB integrato con 25μg/mL carbenicillina.
- Pipettare 15 ml di coltura durante la notte sul 35 millimetri piastre NGM integrata con 25 mg / ml carbenicillina e 1 mM IPTG. Assicurarsi di piastra batteri fuori centro della piastra. Lasciare asciugare (circa 20 minuti).
- Fare 500 ul di soluzione di candeggina fresca (1:1 5M KOH: NaHypochlorite).
- Pipettare 10 ml di soluzione di candeggina sulla piastra di testa di serie. Be t sicuroo posizionare la goccia di candeggina dalla maculatura batterica.
- Per ottenere un piccolo, pulito, la popolazione sincronizzata di clr-1 (e1745) animali da microiniezione contrario, scegliere 2-10 adulti gravide nella goccia di candeggina. Gli adulti si dissolvono, lasciando pulito, in parte evolutivamente scena embrioni. Questi embrioni poi schiudono e le larve si strisciare verso il cibo.
- Incubare per quattro giorni a 20 ° C.
- Spostare le piastre a 25 ° C per quattro ore per indurre gonfiore.
- Scegli vermi di una piastra NGM testa di serie e lasciare il tempo per eliminare i batteri dalla cuticola. (Passaggio facoltativo) Lavare vermi in M9 durante il trasferimento alle piastre NGM.
- Spostare L4/Young adulti (YA) vermi beneficiari di una piastra di testa di serie NGM piatto e lasciare il tempo per eliminare i batteri dalla cuticola. (Passaggio facoltativo) Lavare vermi in M9 durante il trasferimento alle piastre NGM.
A2) preparazione alternativa di vermi donatori con GLP-1 (RNAi)
- Da un piatto striatodi LB + 25 mg / ml carbenicillina inoculare una coltura overnight 3 mL di LB supplementato con carbenicillina con una singola colonia di GLP-1 (RNAi) batteri. Incubare a 37 ° C per una notte.
- Pipettare 15 ml di GLP-1 (RNAi) cultura durante la notte su una piastra di NGM 35 millimetri integrata con 25 mg / ml carbenicillina e 1mM IPTG. Incubare a temperatura ambiente per una notte.
- Trasferimento cinque L3/L4 animali per i GLP-1 (RNAi) piatti. Incubare per due giorni a 20 ° C. La RNAi di mira GLP-1 risultati nella progenie con difetti di proliferazione della linea germinale. L'incapacità di sviluppare appieno i risultati germinali in uno spazio non occupato che si riempie di liquido extracellulare. Ottimizzazione del cibo RNAi di generare progenie che il progresso verso l'età adulta senza germlines proliferative può essere necessario a seconda.
- Hanno preparato pal-l (RNAi) piastre come in passi 2,1-2,3 del protocollo di preparazione clr-1 (e1745) vite senza fine di cui sopra.
- Effettuare una nuova soluzione di candegginazione (1:1 5M KOH: NaHypochlorite).
- Pipettare 10 ml di soluzione di candeggina sul pal-1 testa di serie (RNAi) piastra. Assicurarsi di posizionare la goccia di candeggina dalla maculatura batterica.
- Trasferire gli embrioni con la scelta di 2-10 gravide GLP-1 (RNAi) adulti nella goccia di candeggina.
- Incubare per quattro giorni a 20 ° C.
- Scegli vermi a testa di serie una piastra NGM 60mm e avere il tempo di eliminare i batteri dalla cuticola. (Passaggio facoltativo) Lavare vermi in M9 durante il trasferimento alle piastre NGM.
B2) Alternative preparazione di vermi donatori con ablazione laser linea germinale
- Streak i batteri che esprimono dsRNA per singole colonie su LB + 25 mg / mL piastre carbenicillina. Useremo pal-1 dsRNA batteri che producono per questa dimostrazione. Incubare per una notte a 37 ° C.
- Da una piastra con carbenicillina inoculare una coltura overnight mL 3 in LB supplementato con 25 mg / ml carbenicillina.
- Pipettare 15 ml di secolocultura e una notte di pal-1 dsRNA che esprimono i batteri su piastre NGM 35 millimetri integrati con 25 mg / ml carbenicillina e 1mM IPTG. Lasciare asciugare durante la notte.
- Isolare gli animali L1 da standard OP50 piatti e laser ablazione del precursore cellule somatiche linea germinale Z1 e Z4 con un protocollo standard 3.
- Recupera vermi laser ablazione sui suddetti pal-1 piastre RNAi.
- Incubare per 3 giorni a 20 ° C.
- Scegli vermi ad una piastra NGM pulito e avere il tempo di eliminare i batteri dalla cuticola. (Passaggio facoltativo) Lavare vermi in M9 durante il trasferimento alle piastre NGM.
Preparazione di vermi destinatario
- Streak su OP50 per singole colonie su piastre di LB. Incubare per una notte a 37 ° C.
- Dalla piastra LB inoculare una coltura durante la notte in 3 mL LB.
- Pipettare 15 ml di cultura durante la notte su piastre da 35 mm NGM. Assicurarsi di piastra batteri fuori centro della piastra. Lasciare asciugare (circa 20 minuti).
- Fai una nuova soluzione di candeggina (1:1 5M KOH: NaHypochlorite).
- Pipettare 10 ml di soluzione di candeggina sulla piastra di testa di serie. Assicurarsi di posizionare la goccia di candeggina dalla maculatura batterica.
- Trasferire gli embrioni con la scelta di 2-10 adulti N2 gravide nella goccia di candeggina.
- Incubare per tre giorni a 20 ° C.
- Spostare i vermi per un ambiente pulito, piastra NGM testa di serie e incubare a 20 ° C per almeno 30 minuti.
3. Isolamento del Vampiro di liquido extracellulare
Il seguente protocollo è specifico di una microiniezione set-up costituito da un pli-100 pico-iniettore, un ago stazionaria tenuto in un micromanipolatore, ed una fase mobile in cui la vite senza fine può essere inserita l'ago. Tuttavia, la tecnica è generalizzata per inserire un ago vuoto microiniezione in un animale donatore, mantenendo una pressione sufficiente a prevenire capillare in flusso di olio minerale prima entrata e cellulare mariale mentre penetrare il corpo-wall tessuto. Mentre l'ago è in una pressione animale donatore è ridotta per consentire il riempimento capillare dell'ago con liquido extracellulare, che possono poi essere spostato in dell'ago di un verme destinatario ed espulso aumentando la pressione sufficientemente. Rimozione del liquido per capillarità può essere assistita mediante il riempimento, o aspirazione, funzione del pico-iniettore. Questa tecnica generalizzata dovrebbe essere facilmente adattabile ad altri micro-sistemi di iniezione che consentono il controllo della pressione di equilibrio.
- Accendere il microscopio invertito, il microscopio dissezione, e pico-iniettore (vedi figura 1).
- Ruotare la manopola di selezione del Pico iniettore P chiaro, e verificare che la misura attuale è in psi. Questa lettura, la pressione chiara, è la pressione di ingresso e dovrebbe essere di circa 0 psi.
- Controllare la valvola primaria sul regolatore serbatoio di azoto per assicurarsi che l'uscita è chiusa (girare counterclockwise fino a quando la manopola è allentato).
- Aprire la valvola principale serbatoio di azoto. Il manometro del regolatore più vicino al serbatoio N2 dovrebbe leggere la pressione interna del serbatoio.
- Aumentare lentamente la pressione fuori girando la valvola principale del regolatore in senso orario. Monitorare la pressione crescente sul pico-iniettore (questo è più accurata rispetto alla lettura di uscita pressione sul manometro del regolatore). Aumentare lentamente la pressione a 100 psi. NON PERMETTERE superare il 105 psi.
- Quando si raggiunge 100 psi commutare il selettore su P iniettare e impostare la pressione di iniezione a 30 psi utilizzando la manopola Pinject.
- Ruotare la manopola di selezione per l'equilibrio P.
- Mettere a 15 gocce ml di olio minerale sul donatore pulito e piastre destinatario.
- Copri la tua 2% pad iniezione agarosio in olio minerale.
- Caricare l'ago micropipetta tirato nel supporto e allineare.
- Utilizzando un microscopio dissezione, montare 1 donatore e ricevente 1 verme vicino all'altro sulla p agarosioannuncio.
- Vermi posizione con basso ingrandimento e portare l'ago nella olio minerale nei pressi del donatore.
- Sposta in alto potere e la posizione dell'ago nei pressi di una cavità pseudocoelomic.
- Aumentare la pressione di equilibrio di circa 10 psi. Nota un tappo olio minerale sulla punta dell'ago.
- Spingere il verme nell'ago per posizionare la punta dell'ago nella cavità pseudocoelomic spostando il palco.
- Nota un salto nella posizione dell'olio minerale nella punta dell'ago.
- Ridurre la pressione di equilibrio per consentire un'azione capillare di riempire l'ago. (Si può anche utilizzare la funzione di riempimento per accelerare il processo).
- Dopo aver raccolto diapositiva fluido il verme lontano dall'ago.
- Passa a bassa potenza di ingrandimento e la posizione dell'ago dal worm destinatario (NON CONSENTONO LA PUNTA AGO DI LASCIARE IL olio minerale). [In alternativa, il supporto dell'ago può essere rimosso e il fluido trasferito a una goccia in una provetta da microcentrifuga.]
- Tornare allaalto ingrandimento e spostare l'ago nel verme destinatario facendo scorrere del microscopio.
- Una volta posizionato il verme destinatario utilizzano l'iniezione (impostato a 35 psi) per iniettare il fluido pseudocoelomic raccolti dal donatore.
- Rimuovere l'ago dal verme destinatario facendo scorrere la fase microscopio nella direzione opposta come usato per immettere il destinatario.
- Con l'ago di del worm, sollevare l'ago dal pad iniezione.
- Rimuovere il tampone di iniezione e mettere una goccia di M9 sui vermi per recuperare.
- Mettere una goccia 10 ml di M9 su una piastra di analisi.
- Scegli il worm destinatario nella M9 sulla piastra di dosaggio.
4. Il saggio di trasferimento fenotipica RNAi
- Lasciare vermi recuperati a crescere per 24 ore a 20 ° C.
- Rimuovere adulti destinatari, lasciando embrioni e progenie nati sul piatto. Incubare la piastra per ulteriori 24 ore a 20 ° C.
- Punteggio progenie comenon avendo covato, covato ma essendo fenotipicamente mutante, o di essere wild-type larve.
Note
- NGM supporto è realizzato in 1 litro lotti aggiungendo 18 g di agar, 2,5 g di bactopeptone, 3 g di sodio cloruro e H 2 O. Aggiungi mescolare bar e autoclave. Dopo autoclave mettere il pallone su una piastra agitazione e lasciare che i supporti raffreddare a 60 ° C agitando. Dopo che il supporto è raffreddato, aggiungere 1 ml di colesterolo (5 mg / ml in etanolo), 1 ml di 1M CaCl 2, 1 ml di 1M MgSO 4, 25 mL di tampone fosfato di potassio (pH6.0). Se le piastre sono da utilizzare per l'RNAi NGM è integrato con 1 mL di IPTG 1M e 1 ml di 25 mg / ml carbenicillina dopo raffreddamento a 60 ° C. Le piastre sono versati sia in 35 mm (3,5 ml di NGM) o 60 mm (8,5 ml di NGM) piastre Petri.
- 2% agarosio effettuate in acqua. Conservare in frigorifero. Fondere e accertarsi che gli elettrodi con largo anticipo rispetto al giorno di isolamento fluido pseudocoelomic. La secchezza del pad rende il worm aderire al pad,e un minimo di un giorno di essiccazione dell'aria è necessaria per i pad per essere secca. Se le pastiglie iniezioni sono troppo secchi e le vostre vermi donatori sono essiccare più velocemente di quanto si possa manipolarli è possibile aggiungere l'umidità supplementare ai pad iniezione respirando sul pad prima di aggiungere olio minerale. Indipendentemente dalla capacità di lavorare rapidamente per isolare il fluido pseudocoelomic prima che si asciughi a vite senza fine è assolutamente necessario.
- Usiamo carbenicillina in tutte le fasi della nostra preparazione dei cibi RNAi per selezionare il marcatore di resistenza all'ampicillina. Carbenicillina è un analogo ampicillina che è più stabile e risultati in meno rispetto colonie satellitari ampicillina.
- Usiamo lastre RNAi che sono integrati con NGM 1mM IPTG e 25 mg / ml carbenicillina. I vettori di alimentazione RNAi sono in HT115 E. coli ceppo che è carente per una specifica dsRNA nucleasi.
- (Passaggio facoltativo) Troviamo che in un'ora donatore unseeded piastre NGM e vermi dei destinatari fare un lavoro adeguato perdere la cuticolabatteri associati che viene riportato dalle piastre di alimentazione. Questo non è vero anche se nel caso in cui il bersaglio RNAi nel donatore interferisce con la mobilità (ad es unc-22 (RNAi)). Diventa pertanto necessario aiutare nel processo. Per fare ciò, si usa una diapositiva depressione con circa 50 ml di M9. Picking vermi nella M9 da lastre di alimentazione di RNAi, poi mescolando con un pick standard di verme platino è sufficiente a rimuovere i batteri più aderenti.
5. Risultati rappresentativi
Presentato sono risultati rappresentativi per il trasferimento sperimentale per liquido extracellulare da clr-1 (e1745) vermi coltivati sui batteri che esprimono dsRNA di mira pal-1. La progenie degli animali donatori morti e / o esposti difetti patterning posteriori. Abbiamo poi trasferito fluido extracellularedi questi animali al pseudoceloma di RNAi naive wild-type vermi. Una porzione della progenie successiva dell'animale ricevente quindi visualizzate i fenotipi attesi pal-1 mutante (Figura 4). Questo è in contrasto con la progenie di animali destinatario che ha ricevuto fluido extracellulare da donatori coltivate su entrambi cibo standard batterica o di controllo vettoriale RNAi batteri che sono solo livelli di fondo di letalità (Figura 4). Mentre progenie dei beneficiari di liquido extracellulare da donatori sottoposti RNAi mostrano un aumento significativo della frequenza di dsRNA fenotipi indotti, la penetranza non è forte come nella progenie degli animali donatori, in cui quasi il 100% in pressofusione di progenie come embrioni non schiuse, e solo rare, animali gravemente deformate schiudono.
Figura 1. Configurazione inversa Vampiric iniezione. Il fo di impostazione appropriatara di installazione microiniezione vampirica inverso è simile a un normale C. elegans rig microiniezione, e comprende un microscopio dissezione, un microscopio invertito con obiettivi 10X e 40X, un palco mobile per il posizionamento, e con il supporto di un micromanipolatore ago per iniezione. Inoltre, un estrattore ago per la preparazione di aghi di iniezione è anche necessario. Unico al protocollo microiniezione rovescio un pico-iniettore che permette un controllo preciso della pressione di equilibrio (ad esempio Warner Instruments PLI-100) è necessario.
Figura 2. Valorizzazione del volume pseudocoelomic. Il volume di fluido pseudocoelomic disponibile per isolamento è insufficiente per dosaggio in animali wild-type. Il volume può essere aumentato da compromettere la regolazione dell'equilibrio osmotico, grazie al trasferimento temperatura di clr-1 (e1745) animali, con conseguente accumulo di liquido chiaro pseudocoelomic (freccia bianca). Inoltre la perdita della gonade mediante ablazione laser o di GLP-1 (RNAi) consente l'accesso al fluido extracellulare (perdita mediante ablazione laser è mostrato). Il fluido è più facilmente disponibile osservato come cerotti chiari tra l'intestino buio e la parete del corpo (freccia nera), anche se il volume totale disponibile è molto minore di quella che si trova in CLR-1 (e1745) animali cresciuti alla temperatura restrittiva.
Figura 3. Vampiric isolamento e il protocollo di trasferimento temporale. Quattro giorni prima del trasferimento sperimentare isolare clr-1 (e1745) embrioni donatori su piastre con RNAi cibo e incubare a 20 ° C. Tre giorni prima di isolare gli embrioni destinatario N2 su OP50. Il giorno dell'esperimento spostare le piastre donatori a 25 ° C per quattro ore. Rimuovere i donatori dopo incubazione a 25 ° C a piastre pulite prive di cibo e passaggio a 20 ° C. Spostare gli animali destinatari per pulire le piastremancano cibo e continuare incubando a 20 ° C. Eseguire esperimento di trasferimento e recuperare vermi beneficiari in OP50 piastre e incubare a 20 ° C. Rimuovere gli animali recipienti dopo 24 ore a 20 ° C. Incubare progenie destinatario per 24 ore a 20 ° C. Punteggio progenie come wild-type, mutante, o unhatched.
Figura 4. Risultati rappresentativi. La perdita di PAL-1 in funzione del destinatario comporta letalità embrionale, o perdita distintivo di sviluppo posteriore (A). 48 ore dopo progenie trasferimento PCF prevista entro le prime 24 ore sono segnati sia come wild-type larve, Pal-1 larve, o embrioni non schiuse. La frequenza di embrioni non schiuse e fenotipicamente Pal-1 larve si combinano per dare una misura di pal-1 (RNAi) fenotipi di trasferimento indotti. Ricevuta di liquido pseudocoelomic da animali cresciuti su PAL-1 dsRNA alimentare produce una forte induzione di associatifenotipi invisibili in recipienti di trasferimento di controllo (B).
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Discussion
Abbiamo qui presentato un nuovo metodo che permette l'isolamento e la caratterizzazione di liquido extracellulare dal modello dell'organismo C. elegans. La tecnica inizia con la manipolazione genetica o fisica di vermi donatori di aumentare il volume totale di fluido extracellulare. Liquido extracellulare è quindi isolato utilizzando una tecnica di microiniezione modificato. I vermi sono montati a secco per microiniezione utilizzando tamponi agarosio per tenere i vermi ancora durante la procedura. L'attaccamento fisico al pad utilizza la potenza essiccare del pad asciutto per tenere idrostaticamente il worm al suo posto. Questo rappresenta una sfida, perché una volta che il worm è montato l'acqua disponibile extracellulare comincia ad essere svuotato dagli animali donatori. E 'quindi indispensabile lavorare velocemente. Può essere utile per alcuni sperimentatori di sospendere i vermi in olio minerale sul pad iniezione, ma non li entrare in contatto con il pad. Dopo aver montato il pad iniezione su °microscopio elettronico, e allineando la vite senza fine e l'ago attendere che il worm di entrare in contatto con il pad e l'abbiano in "monte" in sé. Inoltre, anche se può essere possibile collocare fisicamente vermi su cuscinetti agar durante la microiniezione normale, troviamo che la forza fisica applicata per montare worm può notevolmente velocizzare l'asciugatura di vermi donatori. E 'meglio prendere i vermi donatori in olio minerale, e trasferirli al pad mettendo la punta scelta vicino al pad e permettendo al worm di salire al largo del pick da solo.
Oltre a lavorare rapidamente, è anche necessario per eseguire la tecnica vampirica isolamento pulito per evitare l'infezione. L'introduzione di batteri benigni tipicamente all'interno della cuticola porta ad una infezione persistente e letale. Corretta tecnica elimina il verificarsi di infezione. Si può verificare la pulizia del trasferimento liquido extracellulare utilizzando batteri che possono essere facilmente identificati. Nello sviluppo della tecnica abbiamo trovato beneficial di praticare con ceppi batterici che possono essere seguiti da fluorescenza 4, 5. Se la contaminazione batterica entra il verme donatore viene facilmente osservata entro 24 ore dall'infezione.
Troviamo che i vermi destinatario mostrano un fenotipo più debole RNAi che i vermi donatori. Questo non è sorprendente come i vermi dei donatori sono coltivate su batteri che generano una fonte costante di dsRNA, mentre i destinatari di trasferimento di fluido pseudocoelomic sono sempre una singola dose a concentrazioni fisiologiche normali. È pertanto necessario considerare la limitazione di sensibilità e massimizzare la forza di RNAi nel donatore. L'uso di IPTG per indurre la produzione dsRNA non si comporta in modo prevedibile con più induzione pari più efficiente RNAi. Segnaliamo ai lettori di caratterizzazione pubblicato di efficienza ambientale RNAi (cfr. 6,7,8). Suggeriamo che si determina sperimentalmente il metodo più efficiente della consegna al pr donatoreIOR di isolare liquido extracellulare per l'analisi.
Abbiamo dimostrato che i segnali sistemici silenziamento RNAi alimentato da dsRNA può essere rilevato nel liquido extracellulare. Caratterizzazione di questi segnali hanno dimostrato che l'identificazione e l'analisi genetica di liquido extracellulare è possibile. Anche se abbiamo utilizzato principalmente analisi genetica per caratterizzare questi segnali extracellulari, dovrebbe anche essere possibile effettuare analisi molecolare del fluido extracellulare. Fluido estratto può essere trattata, chimicamente o enzimaticamente, prima del trasferimento. Inoltre, il fluido da animali multiple possono essere raccolti in una micro-centrifuga provetta per analisi molecolare. Messa in comune di materiale da più donatori per il trasferimento in un singolo donatore è difficile, anche se può risultare possibile con la pratica. Con la raffinatezza e l'adattamento si prevede future applicazioni che vanno ben al di là di ulteriore caratterizzazione di RNAi indurre segnali extracellulari. L'identificazione e la caratterizzazione diRNA endogeni segnalazione sistemiche, analisi genetica dello sviluppo di vie di segnalazione intracellulari, l'ambiente ei cambiamenti indotti nella composizione extracellulare può essere possibile adattando questa tecnica.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo riconoscere la natura collaborativa del laboratorio Hunter, e li ringrazio per la discussione è stata utile e l'assistenza che ha reso lo sviluppo di questa tecnica possibile e divertente. Vorremmo ringraziare Nigel Delaney e il Caenorhabditis Genetica Centro per la vite senza fine e ceppi batterici. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health GM089795 sovvenzione CPH.
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