Summary
Model organizma
Abstract
Genetik uysal model organizma C. elegans büyüme ve küçük boyutu kolaylığı, kısa döl süresi olarak etkin, biyolojik soruları sayısız içgörüler sağladı. Bu küçük boyutlu olsa da, diğer model sistemlerde bulunan teknik yaklaşımlar bir dizi izin vermemesi. Örneğin, memeli sistemlerinde ve bitkilerde aşılama teknikleri, kan transfüzyonları dolaşım sistemi bileşimi ve sinyalizasyon sorular sorarak etkinleştirdiğinizde. Son zamanlarda doğrudan test edilmesi imkansız kadar solucanın dolaşım sistemi, pseudocoelom vardır. Hücrelerarası sinyalizasyon ve dolaşım sistemi kompozisyon C. soruları cevaplamak için elegans araştırmacılar geleneksel genetik analiz, hücre / doku spesifik kurtarma ve mozaik analizi döndü. Bu teknikler hücreler arasında ne olup bittiğini anlaması için bir araç sağlar, ancak ekstrasellüler moleküllerin tanımlanması ve karakterizasyonu evrensel olarak geçerli değildir. Burada biz ne sunuyoruzdoğrudan tahlil C. pseudocoelomic sıvı WLY geliştirilmiş tekniği elegans. Tekniği ekstraselüler sıvı hacmini artırmak için genetik veya fiziksel manipülasyon ile başlar. Daha sonra hayvanların ince bir denge basıncı kontrolü sağlayan bir mikroenjeksiyon kulesi kullanarak bir vampir ters mikroenjeksiyon tekniği tabi tutulur. Ekstrasellüler sıvı izolasyonundan sonra, toplanan sıvı diğer hayvanların içine transferi ile ya da moleküler araçlar ile tayin edilebilir. Bu tekniğin etkinliğini göstermek için bir sistemik RNAi yanıtı sırasında tahlil ekstraselüler sinyal molekülleri, uzun dsRNA belirli bir örnek için ayrıntılı bir yaklaşım sunmak. Sistemik RNAi karakterizasyonu prensibi örnek bir kanıtı olsa da, biz dolaşım sistemi bileşimi ve sinyalizasyon soruları çeşitli cevaplamak için adapte olarak bu tekniği görmek.
Protocol
1. Malzemelerinin Hazırlanması
Vampirimsi ters Mikroenjeksiyon için gerekli malzeme transgenik C'ye yapmak için kullanılan standart mikroenjeksiyon teknikleri için gereken ile benzerdir elegans suşlar 1. Bazı reaktifler (ör. test plakaları) deneysel transfer günü yapılmasına rağmen, malzemelerin çok koordineli bir 8 gün süresi (zaman tablo için bakınız Tablo 1) fazla hazırlıklı olmalıdır. Bunun gibi, (gerekli reaktifler ve ekipman için Tablo 2'ye bakınız) bu tekniği kullanırken dikkatli önceden plan yapmak önemlidir.
Enjeksiyon pedleri:
- Çözünene kadar bir% 2 agaroz H2O içinde çözelti ve ısı edin. 4 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza 1ml alikotları tablet ° C.
- Onların kenarları biraz çabuk toplayıp kolaylaştırmak için tezgah üst kenarından çıkıntı yapan bir tezgah üstünde 22 x 50 mm kapak bardak serin.
- Pokmikrosantrifüj tüp kapağının adet küçük delik (bir raptiyedir kullanın) havalandırma izin vermek. Eritmek için yaklaşık olarak 5 mL su, ve mikrodalga (yaklaşık 35 saniye) ile, 15 mL beher içinde yerleştirilir.
- Pasteur pipeti ve ampul yerine bir kapak camına erimiş agaroz Bir damla (yaklaşık 35 mcL) ve hemen ilk 90 ° 'lik açıyla açılan üzerinde ikinci bir cam kapak yerleştirin kullanma. Diğer birçok kapak bardak için tekrarlayın.
- Agaroz katılaşmış sonra, kapak camı ile ped (er gerekirse, slaytlar 15-30 dakika için 50-80 ° C fırın içinde konulabilir) tamamen gece boyunca havayla kurumaya olanak tanır.
- Tamponlar sonsuza kadar oda sıcaklığında bir kapak cam kutu içinde muhafaza edilebilir.
Test plakaları:
Test edilmesi için PAL-1 RNAi, tahlil plakaları hazırlanması ile ilgili embriyonik öldürücü vampiric deney gününde yapılmalıdır. Hedef ha birsolucanlar açlıktan değil ise minimum bakteriyel çim ettik. Küçük, saydam deforme L1 hayvanların kolayca gıda kaybolmuş olabilir gibi bir aşırı kalın çim Pal-1 larvaları son derece zor puanlama yapar. Plaka hazırlığı ilgi fenotipi puanlama için optimize edilmelidir.
- OP50 hazırlayın: LB broth Tohum 5mLs LB agar plaklarına yetiştirilen tek OP50 kolonisi. Titreme sırasında ° C de bir gece 37 OP50 inkübe, daha sonra 4 ° C de saklamak
- (Not 1'e bakınız) temel protokole göre 35 mm NGM plakalar hazırlayın.
- Her NGM tabağa gecede OP50 kültürü (adım 1.7) Spot 20 mcL. LB-OP50 (Bu 20 dakikadan az sürer) kurumasını bekleyin.
Enjeksiyon İğneler:
- (Temsili iğne şekli için bakınız Şekil 1) Sutter araçlardan bir P97 alev / kahverengi mikropipet çektirmenin kullanarak borosilikat cam kılcal enjeksiyon iğneleri çekin.
- Mağaza enjeksiyonuBir iğne tutucu iğneler bir Petri plaka ve kil modelleme (1) inşa.
2. Solucanların hazırlanması
Bir yetişkin C. tahmini pseudocoelomic hacmi elegans hermafrodit 40-80 pikolitre (pers com. David Hall) 'dir. Böyle küçük bir rezervuar gelen ekstrasellüler sıvı örnekleri elde etmek için bu toplam kullanılabilir kaynak artırmak için faydalıdır. Büyük ölçüde verici solucanlar içinde mevcut sıvı artırmak için üç yöntem tanımlanmıştır. Bizim birincil yöntem ekstraselüler sıvı hacmi (Şekil 2) 10 kat veya daha fazla artışı neden olabilir clr-1 (e1745) mutantlar, fenotipini patlatır. Iki alternatif yöntem hemen hemen bir solucan toplam hacminin üçte biri ve pseudocoelomic sıvı olan hayvanlarda GLP-1 (RNAi) ya da lazer ile kesip alma sonuçları ile uzaklaştırılması için germline hesaplar germline boşluk doldurma olması (Şekil 2) kullanmak 2 </> Sup.
CLR-1 (e1745) kullanarak verici solucanlar hazırlanması
Clr-1 (e1745) transferi testi iş akışı için Şekil 3'e bakınız
- LB + 25μg/mL karbenisilin plakaları tek koloniler için dsRNA ifade bakterileri Streak. Bu gösteri için pal-1'in dsRNA üreten bakterilerin kullanacaktır. 37 gece inkübe ° C
- Bir streaked LB + 25 mcg / pal-1 (RNAi) bakteri mL karbenisilin plaka itibaren 25μg/mL karbenisilin desteklenmiş LB bir 3 ml gecede kültür aşılamak için tek bir koloni seçin.
- 35mm NGM gece boyunca kültür levhaları üzerine bir pipetle 15 ul 25 mg / ml karbenisilin ve 1 mM IPTG ile desteklenmiştir. Plakanın merkezinde kapalı plaka bakteri emin olun. (Yaklaşık 20 dakika) kurumasını bekleyin.
- 500 mcL taze çamaşır suyu çözeltisi (: NaHypochlorite 01:01 5M KOH) olun.
- Seeded plaka üzerinde çamaşır suyu çözeltisi pipetle 10 mcL. Emin t oluno bakteriyel leke uzak ağartıcı damlacığı yerleştirin.
- Clr-1 (e1745) ters mikroenjeksiyon için hayvanların küçük, temiz, senkronize nüfus elde etmek için, çamaşır suyu damla içine 2-10 gravid yetişkin almak. Yetişkin temiz, kısmen gelişimsel embriyolar sahnelenen bırakarak, çözülür. Bu embriyolar daha sonra yumurtadan ve larva gıda tarıyor.
- 20 ° C'de dört gün için inkübe
- ° C dört saat boyunca şişlik ikna etmek için 25 plakaları Shift.
- Bir dereceye giremeyen NGM plaka solucanlar seçin ve manikür gelen bakterileri temizlemek için zaman tanıyın. NGM plakalar aktarma sırasında (OPSİYONEL ADIM) M9 solucanlar yıkayın.
- Bir dereceye giremeyen plaka NGM tabağa L4/Young Yetişkin (YA) alıcı solucanlar hareket ettirin ve manikür gelen bakterileri temizlemek için zaman tanıyın. NGM plakalar aktarma sırasında (OPSİYONEL ADIM) M9 solucanlar yıkayın.
A2) GLP-1 kullanarak donör solucanlar Alternatif hazırlanması (RNAi)
- Bir çizgili plaka GönderenLB + 25 ug / ml karbenisilin GLP-1 (RNAi) bakteri, tek bir koloni ile karbenisilin ile desteklenmiş LB bir 3 mL gece boyunca kültür inoküle. 37 ° C de bir gece inkübe edin.
- Pipet 25 ug / mL karbenisilin ve 1 mM IPTG ile desteklenmiş bir 35 mm plaka üzerine NGM GLP-1 ile 15 ul (RNAi) gece boyunca kültür. Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- GLP-1 (RNAi) plakalara beş L3/L4 hayvanlar aktarın. 20 ° C'de iki gün için inkübe RNAi germline çoğalması kusurları ile döl GLP-1 sonuçları hedefleme. Yetersizlik tamamen ekstrasellüler sıvı ile doldurur boş uzayda germline sonuçları geliştirmek için. Proliferatif germlines olmadan erişkin ilerleme bağlı olarak gerekli olabilir döl RNAi gıda Optimizasyonu.
- Yukarıda clr-1 (e1745) solucan hazırlık protokolü adımlarla 2.1-2.3 olarak pal-l (RNAi) plakaları hazırladık.
- Taze bir ağartıcı çözüm oluntion (1:1 5M KOH: NaHypochlorite).
- Seeded pal-1 (RNAi) plaka üzerinde çamaşır suyu çözeltisi pipetle 10 mcL. Bakteriyel leke uzak ağartıcı damlacığı yerleştirin emin olun.
- Ağartıcı damlacık içine 2-10 gravid GLP-1 (RNAi) yetişkin seçerek embriyolar transfer.
- 20 ° C'de dört gün için inkübe
- Bir dereceye giremeyen 60mm NGM plaka solucanlar seçin ve manikür gelen bakterileri temizlemek için zaman tanıyın. NGM plakalar aktarma sırasında (OPSİYONEL ADIM) M9 solucanlar yıkayın.
Germline lazer ablasyon kullanarak donör solucanlar B2) Alternatif hazırlanması
- LB + 25 mg / ml karbenisilin plakaları tek koloninin için dsRNA ifade bakterileri Streak. Bu gösteri için pal-1'in dsRNA üreten bakterilerin kullanacaktır. 37 gece inkübe ° C
- Karbenisilin içeren bir plaka ila 25 ug / mL karbenisilin ile desteklenmiş LB içinde bir 3 mL gece boyunca kültür inoküle.
- Th Pipet 15 mcLPAL-1 e bir gecelik kültürü dsRNA eksprese eden 25 ug / mL karbenisilin ve 1 mM IPTG ile desteklenmiş 35 mm NGM plakalar üzerine bakteri. Gecede kurumasını bekleyin.
- Standart OP50 plakalardan L1 hayvanlar izole ve lazer standart bir protokol 3 kullanarak somatik germline prekürsör hücrelerinin Z1 ve Z4 uzaklaştırılmasıdır.
- Anılan pal-1 RNAi plakalar üzerinde ablasyon solucanlar kurtarın.
- 20 ° C de 3 gün boyunca inkübe
- Temiz bir NGM plaka solucanlar seçin ve manikür gelen bakterileri temizlemek için zaman tanıyın. NGM plakalar aktarma sırasında (OPSİYONEL ADIM) M9 solucanlar yıkayın.
Alıcının solucanlar hazırlanması
- LB plakaları tek koloniler için OP50 üzerinden Streak. 37 gece inkübe ° C
- LB plaka itibaren LB bir 3 ml gecede kültürü aşılamak.
- 35 mm NGM plakalar üzerine gecede kültür Pipet 15 mcL. Plakanın merkezinde kapalı plaka bakteri emin olun. Kurumasını bekleyin (yaklaşık 20 dakika).
- Taze bir çamaşır suyu çözeltisi (: NaHypochlorite 01:01 5M KOH) olun.
- Seeded plaka üzerinde çamaşır suyu çözeltisi pipetle 10 mcL. Bakteriyel leke uzak ağartıcı damlacığı yerleştirin emin olun.
- Ağartıcı damlacık içine 2-10 gravid N2 yetişkin seçerek embriyolar transfer.
- 20 ° C'de üç gün süreyle inkübe
- En az 30 dakika süreyle 20 ° C 'de bir temiz, seri başı olmayan NGM plaka ve inkübe için solucan taşır.
3. Ekstrasellüler Akışkan Vampiric İzolasyonu
Aşağıdaki protokolü pli-100 pico-enjektör, bir micromanipulator düzenlenen bir sabit iğne ve solucan iğne içine kaydırdı hangi bir yüzer sahne oluşan set-up bir mikroenjeksiyon özgüdür. Yeterli giriş öncesinde mineral yağ akışı kılcal önlemek için basınç ve hücresel ma korurken Ancak, genelleştirilmiş tekniği, bir donör hayvanların içine boş bir mikroenjeksiyon iğne eklemek içinvücut duvarı doku nüfuz ederken terial. Iğne, bir verici hayvanın basınç dahilinde olsa da, daha sonra bir alıcı solucan için iğne ile taşınması ve yeterince basınç artırılması ile de kesilebilir hücre dışı sıvı, iğne ile kılcal dolgu izin verecek şekilde indirgenir. Kapiler hareket ile sıvı uzaklaştırılması, ayrıca dolgu ile destekli veya pico-enjektörün emme, fonksiyon edilebilir. Bu genelleştirilmiş tekniği denge basıncı kontrolünü sağlayan diğer mikro-enjeksiyon sistemleri kolayca uyarlanabilir olmalıdır.
- Inverted mikroskop, diseksiyon mikroskobu ve pico-enjektör (Bakınız Şekil 1) açın.
- P açık için Pico enjektör seçim topuzunu çevirin ve akım ölçümü psi olduğunu kontrol edin. Bu okuma, berrak basınç, giriş basıncı ve yaklaşık olarak 0 psi olmalıdır.
- (Countercl çevirin çıkışı kapalı olduğundan emin olmak için azot tankı regülatör üzerindeki birincil valfi kontrol edintopuzu gevşek) kadar ockwise.
- Ana azot tankı vanasını açın. N2 tankı yakın regülatörü göstergesi artık tankın iç basıncı okumalısınız.
- Yavaşça saat yönünde birincil regülatör valfı çevirerek dışarı basınç artışı. Pico-enjektör üzerindeki artan baskı izleyin (bu daha regülatörü göstergesindeki çıkış basınç okuması daha doğru). Yavaşça basıncı 100 psi artırın. 105 psi AŞMAYACAKTIR İZİN VERMEYİN.
- 100 psi enjekte ve enjeksiyon basıncı Pinject topuzunu kullanarak 30 psi ayarlanmış P olarak seçici geçiş ulaşıldığında.
- P dengesi seçme düğmesini açın.
- Sizin temiz donör ve alıcı plakalar üzerinde mineral yağ, 15 mcL damlacığı yerleştirin.
- Mineral yağ içinde% 2'lik agaroz enjeksiyon pedi örtün.
- Tutucuya çekti mikropipet iğne yerleştirin ve hizalayın.
- Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, agaroz p birbirine yakın 1 verici 1 alıcı solucan montereklam.
- Düşük büyütme ve konumu kullanarak solucanlar donör yakınında mineral yağ içine iğne getir.
- Bir pseudocoelomic boşluğu yakınındaki yüksek güç ve konumunu iğne taşıyın.
- Yaklaşık 10 psi denge basıncını arttırın. İğne ucunda bir mineral yağ tapasını unutmayın.
- Sahne hareket ettirerek pseudocoelomic boşluğunda iğne ucu konumlandırmak için iğne içine solucan bastırın.
- İğne ucu içinde mineral yağ konumunda bir atlama not edin.
- Kapiler iğne doldurmak için izin denge basıncı azaltın. (Bir de süreci hızlandırmak için dolgu işlevini kullanabilirsiniz).
- Iğne solucan uzak sıvı slayt topladıktan sonra.
- Düşük güç büyütme ve alıcının solucan (İĞNE TIP MADEN YAĞ TERK İZİN VERMEYİN) tarafından konuma iğne geçin. [Alternatif olarak, iğne tutucu kaldırılır ve akışkan bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir damlacık için transfer edilebilir.]
- Geri dönünYüksek büyütme oranı ve mikroskop sahne kaydırarak alıcı solucan içine iğne taşıyın.
- Bir kez alıcı solucan konumlandırılmış donörden toplanan pseudocoelomic sıvı enjekte enjeksiyon (35 PSI seti) işlevini kullanın.
- Alıcı girmek için kullanılan olarak ters yönde mikroskop aşama kaydırarak alıcı solucanından iğne çıkarın.
- Solucanın iğne dışarı ile, uzak enjeksiyon takımından iğne yükseltmek.
- Enjeksiyon pedi çıkarın ve kurtarmak için solucanlar üzerinde M9 bir damlacık yerleştirin.
- Bir test plakası üzerinde M9 bir 10 mcL damlacığı yerleştirin.
- Tahlil plaka üzerinde M9 içine alıcı solucan seçin.
4. RNAi Fenotipik Transferi assaying
- Kurtarıldı solucanlar 20 ° C'de 24 saat boyunca büyümeye izin ver
- Plaka embriyolar ve yumurtadan döl bırakarak, alıcının yetişkin çıkarın. 20 ° C'de bir 24 saat daha inkübe plaka
- Puan döl olarak, yumurtadan yumurtadan ama fenotipik mutant olmak, ya da vahşi-tip larva olmamak sahip.
Notlar
- NGM agar ortamı 18 g, bactopeptone 2.5 g, sodyum klorid 3 g ve Y 2 O. ilave edilerek 1-litre gruplar halinde yapılır Bar ve otoklav karıştırın ekleyin. Otoklav sonra bir karıştırma plakası üzerinde şişeye koymak ve ortam 60 soğumasına ° C'de karıştırma sırasında sağlar. Ortam soğuduktan sonra, kolesterol 1 ml (5 mg / ml etanol içinde), 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, potasyum fosfat tamponu ve 25 mL (pH6.0) ve 1 mL 1 ml ekleyin. Plakalar RNAi için kullanılacak ise NGM 60 ° C 'ye soğutulur sonra IPTG 1M, 1 ml ve 25 mg / mL karbenisilin, 1 ml ilave yapılır Plakalar 35 mm (NGM 3.5 mL), veya 60 mm (NGM 8.5 mL) petri levhalar ya da dökülür.
- % 2'lik agaroz su yaptı. Buzdolabında saklayın. Eritin ve iyi pseudocoelomic sıvı izolasyonu gününden pedleri yapmak. Pad kuruluk, solucan pedi uygun yaparpedleri yeterince kuru olması için ve havayla kurutma bir gün, en az gereklidir. Enjeksiyonlar yastıkları çok kuru ve donör solucanlar size mineral yağ eklemeden önce pad üzerinde nefes enjeksiyon yastıkları ek nem ekleyebilirsiniz bunları işleyebilirsiniz daha hızlı kuruttuktan edilir. Eğer Ne olursa olsun solucan kurumadan pseudocoelomic sıvı yalıtmak için hızlı çalışma yeteneği kesinlikle gereklidir.
- Biz ampisilin direnci markör için seçmek için bizim RNAi yemek hazırlama tüm aşamalarda karbenisilin kullanın. Carbenicillin ampisilin daha az uydu koloniler daha istikrarlı ve sonuçlar bir ampisilin benzeşir.
- Biz NGM 1mM IPTG ve 25 mcg / mL karbenisilin ile desteklenmiştir RNAi tabak kullanın. RNAi besleme vektörleri E. HT115 olan Bir dsRNA belirli nükleaz için yetersizdir coli suşu.
- (İsteğe bağlı Adım) Biz dereceye giremeyen NGM plakalar donör ve alıcı solucanlar üzerinde bir saat verilmektedir manikür kaybetme yeterli bir iş yapmak olduğunu bulmakBağımlı bakterilerle besleme plakalar üzerinde taşınır. Olgularda donör hayvan RNAi hedef mobilite uğratır nerede olsa bu doğru değildir (örneğin unc-22 (RNAi)). Bu nedenle, işlem yardımcı olmak için gerekli hale gelir. Bunu yapmak için, biz M9 yaklaşık 50 mcL bir depresyon slayt kullanın. RNAi besleme plakalar M9 içine kurt Toplama, daha sonra, standart bir platin solucan çekme ile karıştırarak en yapışık bakterileri ortadan kaldırmak için yeterli olmaktadır.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Sunan clr-1 (e1745) pal-1 hedefleme dsRNA ifade bakteri yetişen solucanlar ekstrasellüler sıvı için deney aktarımı için temsili sonuçlar vardır. Donor hayvanların döl öldü ve / veya posterior desenlendirme kusurlar sergiledi. Biz sonra ekstrasellüler sıvı transferAyrıca bu hayvanlardan alınan RNAi saf vahşi tip solucanların pseudocoelom için. Alıcı hayvan sonraki döl bir kısmı, daha sonra beklenen PAL-1 mutant fenotipleri (Şekil 4) gösterilmiştir. Bu standard, bakteriyel gıda veya öldürücülük sadece arka plan düzeyleri (Şekil 4) görüntülenen kontrolü RNAi vektör bakteri ya yetiştirilen donör hayvanlardan ekstraselüler sıvı alınan alıcı hayvanların döl tersidir. RNAi dsRNA indüklenen fenotipleri sıklığında belirgin bir artış göstermektedir uygulanan donör hayvanların ekstrasellüler sıvı alıcıların döl, penetrans donör hayvanların döl kadar güçlü olmasa da burada yaklaşık 100 çıkmamış embriyolar gibi döl kalıp ve% sadece nadir, ciddi deforme hayvanların yumurtadan.
Şekil 1. Vampiric ters enjeksiyon kurulum. Uygun kurulum fora vampir ters mikroenjeksiyon kurulumu standart bir C benzer elegans mikroenjeksiyon kulesi ve bir diseksiyon mikroskobu, 10X ve 40X hedefleri ile bir inverted mikroskop, konumlandırma için hareketli bir sahne, ve enjeksiyon iğne tutucu ile mikromanipülatör içerir. Buna ek olarak, enjeksiyon iğneleri hazırlanması için bir iğne çekici de ihtiyaç duyulmaktadır. (Örn. Warner Instruments PLI-100) denge basıncının iyi kontrol sağlayan ters mikroenjeksiyon protokolü pico-enjektör Benzersiz gereklidir.
Şekil 2. Pseudocoelomic hacmi Geliştirme. Izolasyon için mevcut pseudocoelomic sıvının hacmi yabani-tip hayvanlarda test için yeterli değildir. Hacim pseudocoelomic sıvı açık birikimi (beyaz ok) sonuçlanan CLR-1 (e1745) hayvanların ısı değişimi yoluyla ozmotik dengesinin düzenlenmesi bozarak arttırılabilir. Ayrıca lazer ile kesip alma ya da GLP-1 (RNAi) ile gonad kaybı (lazer ile kesip alma ile kaybı gösterilmiştir) hücre dışı sıvı erişimi sağlar. Toplam kullanılabilir hacmi clr-1 (e1745) kısıtlayıcı sıcaklığında yetiştirilen hayvanlarda bulunan çok daha az olmasına rağmen mevcut sıvının en kolay, koyu bağırsak ve vücut duvarı (siyah ok) arasındaki belirgin lekeler olarak görülmektedir.
Şekil 3. Vampiric izolasyon ve transfer protokolü zaman çizelgesi. Dört gün önce deney 20 ° C'de RNAi gıda ve inkübe ile plakalar üzerinde clr-1 (e1745) donör embriyo izole aktarmak için Üç gün önce OP50 üzerine N2 alıcı embriyolar izole. Deney gününde ° C'de dört saat için 25 verici plakaları kaydırır. Gıda ve vardiya eksik temiz plakaları ° C inkübasyon 20 ° C 25 sonrası bağış çıkarın Plakaları temizlemek için alıcı hayvanlar taşıyın20 ° C'de gıda ve kuluçka devam yoksun Transferi deney yapın ve 20 ° C'de OP50 plakaları ve inkübe üzerinde alıcı solucanlar kurtarmak 20 ° C'de 24 saat sonra, alıcı hayvanlar kaldırma 20 ° C'de 24 saat boyunca inkübe alıcı döl Yabani tip ve mutant ya da çıkmamış gibi puanı farklılaşma.
Şekil 4,. Örnek sonuçlanır. Alıcı PAL-1 fonksiyon kaybı embriyonik öldürücü ya da arka gelişme ayırt edici kaybı (A) neden olur. İlk 24 saat içinde atılmıştır PCF transferi döl 48 saat sonra da yabani tip larva, Pal-1 larvaları veya çıkmamış embriyolar olarak puanlanır. Çıkmamış embriyolar ve fenotipik Pal-1 larvaların frekans pal-1 (RNAi) transferi indüklenen fenotipleri bir ölçü vermek için birleştirilir. PAL-1'in dsRNA gıda yetiştirilen hayvanlardan pseudocoelomic sıvı alınması ilişkili güçlü bir indüksiyon üretirkontrol transferi alıcıları (B) görünmeyen fenotipleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz burada model organizma C'den ekstrasellüler sıvı izolasyonu ve karakterizasyonu sağlayan yeni bir yöntem sundu elegans. Tekniği ekstrasellüler sıvı toplam hacmi artırmak için donör solucanlar genetik veya fiziksel manipülasyon ile başlar. Hücre dışı sıvı daha sonra bir modifiye mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak izole edilir. Solucanlar işlem sırasında halen solucanlar tutmak için kuru agaroz pedleri kullanarak mikroenjeksiyon için monte edilmiştir. Pad fiziksel eki hidrostatik yerde solucan tutmak için kuru ped kuruttuktan güç kullanır. Solucan monte kez kullanılabilir ekstraselüler su donor hayvanların tahliye edilmesi başlar, çünkü bu bir meydan okuma sunuyor. Bu nedenle hızlı çalışması için şarttır. Bu enjeksiyon pad üzerinde mineral yağ içinde solucanlar askıya bazı deneyciler için yararlı olabilir, ama onları pad ile temas değil. Th enjeksiyon pedi monte ettikten sonraE mikroskop ve solucan ve iğne hizalayarak pad ile temas yapmak ve "bağlama" kendisi için solucan bekleyin. Fiziksel olarak Normal mikroenjeksiyon esnasında agar yastıkları solucanlar yerleştirmek mümkün olabilir, ancak Ayrıca, biz fiziksel güç solucanlar büyük donör solucanlar kuruma hızlandırabilir montajında uygulanacak bulabilirsiniz. Mineral yağ donör solucanlar pick up ve ped yakın seçim ucu koyarak ve solucan kendi pick off tırmanmaya izin vererek pad aktarmak en iyisidir.
Hızla çalışan ilave olarak, aynı zamanda enfeksiyonu önlemek için temiz vampiric izolasyon tekniği uygulamak gerekebilir. Manikür içinde genellikle iyi huylu bakterilerin giriş kalıcı ve ölümcül enfeksiyona yol açar. Uygun yöntem enfeksiyon oluşumunu ortadan kaldırır. Bir kolaylıkla tanımlanır bakteriler kullanarak ekstraselüler sıvı transferi temizlik için test edebilirsiniz. Tekniği geliştirirken biz benef bulundufloresans 4, 5 ile takip edilebilir bakteri suşları ile uygulamaya icial. Bakteriyel kontaminasyon donör solucan girerse kolayca enfeksiyon 24 saat içinde görülür.
Biz alıcı solucanlar verici solucanlar daha zayıf RNAi fenotip gösterebilir bulabilirsiniz. Pseudocoelomic akışkan transferi alıcıları normal fizyolojik konsantrasyonlarda, tek doz alıyorsanız ise donör solucanlar, dsRNA sabit bir kaynağı üreten bakteriler üzerinde yetiştirilen gibi bu şaşırtıcı değil. Bu nedenle, duyarlılık sınırlama düşünün ve verici olarak RNAi gücü maksimize etmek için gereklidir. DsRNA üretimini sağlamak için IPTG indüksiyonu kullanılması daha fazla verimli RNAi eşit olduğunda, tahmin edilebilir bir şekilde hareket etmez. Biz (6,7,8 bakınız) çevre RNAi verimliliği yayınlanan karakterizasyonu için okuyucuların işaret. Biz bir donör pr deneysel teslim en verimli yöntemi belirler öneririzanalizi için hücre dışı sıvı saptamanın IOR.
Biz beslenen dsRNA sistemik RNAi susturma sinyalleri ekstraselüler sıvı tespit edilebilir olduğunu göstermiştir. Bu sinyallerin karakterizasyonu hücre dışı sıvı tanımlanması ve genetik analizi mümkün olduğunu göstermiştir. Biz öncelikle bu ekstraselüler sinyaller karakterize genetik analizler kullanılmasına rağmen, aynı zamanda ekstrasellüler sıvı moleküler analizler yapmak mümkün olmalıdır. Kaldırılan akışkan transferi önünde, ya kimyasal yada enzimatik olarak, tedavi edilebilir. Ayrıca, birden fazla hayvanlardan elde edilen sıvı moleküler tahlil için, bir mikro santrifüj tüpü içinde toplanabilir. Uygulama ile mümkün kanıtlamak olsa tek bir donör içine transfer için çoklu vericilerden malzeme Pooling, zordur. Incelik ve adaptasyon ile biz ekstraselüler sinyaller uyarıp RNAi ileri karakterizasyonu ötesine gidiyor gelecekteki uygulamalar öngörüyoruz. Tanımlanması ve karakterizasyonuendojen sistemik sinyalizasyon RNA'lar, gelişimsel hücrelerarası sinyal yollarının genetik analiz ve ekstraselüler kompozisyon çevreye bağlı değişikliklerin bu tekniğin adapte ederek mümkün olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Hunter laboratuar işbirlikçi doğasını kabul etmek ister ve bu tekniğin geliştirilmesi mümkün ve eğlenceli hale faydalı tartışma ve yardım için kendilerine teşekkür ederim. Biz Nigel Delaney ve solucan ve bakteriyel suşları için Caenorhabditis Genetik Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri CPH GM089795 hibe ile desteklenmiştir.
References
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans. Development. 130, 1089-1099 (2003).
- Kimble, J. Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).
- Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations. Science. 311, 1615-1617 (2006).
- Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium. Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome. Biol. 2, (2001).
- Min, K., Kang, J., Lee, J. A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 48, 229-232 (2010).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants. Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).
- Way, J. C., Chalfie, M. mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans. Cell. 54, 5-16 (1988).
- Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e, Moreno, S., Sohrmann, M. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, 2456-2459 (2002).
