تنقية الرنا الميكروي والتنميط من Exosomes المشتقة من الدم والثقافة وسائل الإعلام
Summary
وقد ولدت وجود microRNAs مستقرة (miRNAs) في exosomes مصلحة هائلة كوسيلة للاتصال بين الخلايا الرواية، لفائدتها المحتملة والمؤشرات الحيوية وكطريق للتدخل العلاجي. نحن هنا لشرح تنقية exosome من الدم والثقافة وسائل الإعلام تليها الكمية PCR لتحديد miRNAs التي يجري نقلها.
Abstract
Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs are protected from degradation by sequestration in small vesicles called exosomes. Exosomes can fuse with the plasma membrane resulting in the transfer of RNA and proteins to the target cell. Their biological functions include immune response, antigen presentation, and intracellular communication. Delivery of miRNAs that can regulate gene expression in the recipient cells via blood has opened novel avenues for target intervention. In addition to offering a strategy for delivery of drugs or RNA therapeutic agents, exosomal contents can serve as biomarkers that can aid in diagnosis, determining treatment options and prognosis.
Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media.
Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media
Introduction
miRNAs غير مكود قصيرة تعدل التعبير الجيني عن طريق الربط إلى الهدف مرنا. البذور تسلسل التكامل بين ~ 7 أزواج قاعدة تمكن ميرنا لربط مرنا الهدف مما أدى إلى تثبيط الترجمة أو في انخفاض في استقرار مرنا، وكلاهما يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في التعبير عن بروتين الهدف 1. حيث أثبت بحث علمي على مدى العقد الماضي بشكل لا لبس فيه دورا أساسيا لmiRNAs في التوسط في الوظائف الخلوية. وكان هناك أيضا جهدا كبيرا توجه نحو تشريح ميرنا التغيرات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض المختلفة بوساطة 2،3. وعلاوة على ذلك، وتحديد الأخيرة لل miRNAs مستقرة في سوائل الجسم 4-6 مهدت الطريق لاستخدامهم المؤشرات الحيوية رواية قابلة للتشخيص السريري.
وضع واحدة من وسائل النقل ميرنا في سوائل الجسم هو عبر exosomes، حويصلات صغيرة التي تحمل mRNAs و، البروتينات، الدهون وسطاء، وmiRNAs إلى خلايا المتلقي عبر النظامية circulat الدمأيون 7-14. هذه النتائج في التشكيل التعبير الجيني في الخلايا المتلقية ويمثل آلية جديدة للاتصالات الخلوية. على سبيل المثال، يمكن أن الخلايا المناعية تعدل العمليات التنظيمية عن طريق إفراز و / أو exosomes امتصاص الجزيئات الحيوية التي تحتوي على المشاركة في التهاب مثل انترلوكين 1β (IL1β)، عامل نخر الورم α (TNFα)، وتحويل عامل النمو β5 (TGFβ5)، و وmiRNAs التي تنظم هذه الجينات 13. كما الشاذة التعبير ميرنا هو سمة مشتركة في مجموعة متنوعة من الأمراض التي تصيب الإنسان، وهذه الجزيئات فرصا جديدة مثيرة لاكتشاف والتحقق من أهداف علاجية جديدة 2.
miRNAs تعميم موجودة في جميع سوائل الجسم وأنه من المعروف أن تكوين exosomes يختلف استنادا إلى الخلايا المصدر الذي تم الإفراج عنهم. وبالتالي فإنها تقدم وسيلة لدراسة الحالة الفسيولوجية للخلايا وكيف الخلايا يغير إشارة حتىTS ردا على الإجهاد بما في ذلك الأمراض. يمكن دراسة تغيرات في تكوين exosome توفير نظرة ثاقبة نقل الإشارة والتحقيق فائدتها المحتملة والمؤشرات الحيوية أو المسارات التدخل العلاجي.
هنا سوف نظهر تنقية exosomes من مصادر متعددة استنادا إلى البروتوكولات التي تم نشرها. وسوف تستخدم هذه exosomes لعزل الحمض النووي الريبي تليها QPCR لتحديد وقياس مستويات لل miRNAs موجودة في exosomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، وتبين لنا من القياس الكمي لل miRNAs وmRNAs وتنقيته من exosomes بواسطة الطرد المركزي المغاير من الدم والثقافة وسائل الإعلام. Exosomes على مكونات متنوعة تعتمد على أصلهم وتشارك في عدد من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك الاستجابة المناعية، العرض مستضد، الاتصال بين …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من جانب صناديق من ريتا منحة مؤسسة ألين لاجيت سينا. فإن الكتاب أود أن أنوه اريكا بالوغ والدكتور سوميترا Ghoshroy من جامعة ولاية كارولينا الجنوبية مركز المجهري إلكترون للاستخدام الصك، المساعدة العلمية والتقنية.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
