הנוכחות של מיקרו RNA היציב (miRNAs) בexosomes יצרה עניין עצום כמו מצב רומן של תקשורת בין תאית, לשירות שלהם כסמנים ביולוגיים הפוטנציאלי וכנתיב להתערבות טיפולית. כאן אנו מדגימים טיהור exosome מתקשורת והתרבות בדם ואחרי PCR כמו לזהות miRNAs מועברת.
miRNAs יציבה נמצאות בכל נוזלי הגוף וכמה miRNAs מחזור מוגנת מפני השפלה על ידי תפיסה בשלפוחית קטנה בשם exosomes. Exosomes יכול להתמזג עם קרום הפלזמה וכתוצאה מכך ההעברה של רנ"א וחלבונים לתא המטרה. התפקודים הביולוגיים שלהם כוללים תגובה חיסונית, מצגת אנטיגן, ותקשורת תאית. מסירה של miRNAs שיכול לווסת את ביטוי הגנים בתאים המקבלים באמצעות דם פתחה אפיקים חדשים להתערבות היעד. בנוסף מציע אסטרטגיה למשלוח של תרופות או סוכנים טיפוליים RNA, תוכן exosomal יכול לשמש כסמנים ביולוגיים שיכול לסייע באבחון, קביעת אפשרויות טיפול וסיכויי החלמה.
כאן אנו מתארים את הליך ניתוח miRNAs כמותית וRNAs שליח (mRNA) מexosomes המופרש בדם ותרבות תקשורת סלולרי. exosomes המטוהר יהיה מאופיין באמצעות ניתוח כתם מערבי לexosסמני omal וPCR לmRNAs של עניין. מיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים (TEM) וסימון immunogold ישמש כדי לאמת את המורפולוגיה והיושרה exosomal. סך RNA יהיה מטוהר מexosomes אלה כדי להבטיח שאנחנו יכולים ללמוד גם ה-mRNA ומירנה מהמדגם הזהה. לאחר אימות תקינות הרנ"א על ידי Bioanalyzer, נבצענו אמיתי תפוקת כמותית PCR בזמן בינוני (qPCR) כדי לזהות את מירנה exosomal באמצעות מערך TaqMan בצפיפות נמוך (TLDA) כרטיסים ומחקרי ביטוי גנים לתעתיקים של עניין.
פרוטוקולים אלה יכולים לשמש כדי לכמת את השינויים בmiRNAs exosomal בחולים, מודלים של מכרסמים ותרבות תקשורת סלולרי לפני ואחרי ההתערבות תרופתית. תוכן Exosomal להשתנות בהתאם למקור של המקור ואת התנאים הפיסיולוגיים של תאים המפרישים exosomes. וריאציות אלו יכולות לספק תובנות על אופן בו תאים ומערכות להתמודד עם מתח או הפרעות פיסיולוגיות. הנתונים שלנו מראים היציגים Variations בmiRNAs להציג בexosomes מטוהר מהדם עכבר, דם אדם ותקשורת בתרבות של תאי אדם.
כאן אנו מתארים את הליך ניתוח miRNAs כמותית וRNAs שליח (mRNA) מexosomes המופרש בדם ותרבות תקשורת סלולרי. exosomes המטוהר יהיה מאופיין באמצעות ניתוח כתם מערבי לסמני exosomal וPCR לmRNAs של עניין. מיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים (TEM) וסימון immunogold ישמש כדי לאמת את המורפולוגיה והיושרה exosomal. סך RNA יהיה מטוהר מexosomes אלה כדי להבטיח שאנחנו יכולים ללמוד גם ה-mRNA ומירנה מהמדגם הזהה. לאחר אימות תקינות הרנ"א על ידי Bioanalyzer, נבצענו אמיתי תפוקת כמותית PCR בזמן בינוני (qPCR) כדי לזהות את מירנה exosomal באמצעות מערך TaqMan בצפיפות נמוך (TLDA) כרטיסים ומחקרי ביטוי גנים לתעתיקים של עניין.
פרוטוקולים אלה יכולים לשמש כדי לכמת את השינויים בmiRNAs exosomaln חולים, מודלים של מכרסמים ותרבות תקשורת סלולרי לפני ואחרי ההתערבות תרופתית. תוכן Exosomal להשתנות בהתאם למקור של המקור ואת התנאים הפיסיולוגיים של תאים המפרישים exosomes. וריאציות אלו יכולות לספק תובנות על אופן בו תאים ומערכות להתמודד עם מתח או הפרעות פיסיולוגיות. נתונים המייצגים שלנו מראים שינויים בmiRNAs להציג בexosomes מטוהר מהדם עכבר, דם אדם ותקשורת בתרבות תאים האנושית
miRNAs noncoding קצר לווסת ביטוי גנים באמצעות הקשירה mRNA היעד. השלמת רצף זרע ~ 7 זוגות בסיסים מאפשרת מירנה להיקשר לmRNA המטרה וכתוצאה מכך העיכוב של תרגום או בירידה ביציבות של ה-mRNA, אשר שניהם יכולים לגרום לירידה בביטוי של חלבון 1 היעד. מחקר בעשור האחרון הוכיח באופן חד משמעי לתפקיד בסיסי miRNAs בתיווך תפקודים תאיים. יש גם מאמץ ניכר מכוון לנתח שינויים מולקולריים העומדים בבסיס תיווך מירנה מחלות שונות 2,3. יתר על כן, זיהוי האחרון של miRNAs יציבה בנוזלי גוף 4-6 סלל את הדרך לשימוש בם כסמנים ביולוגיים חדשניים המתאימים לאבחנה קלינית.
מצב אחד של התחבורה מירנה בנוזלי גוף הוא באמצעות exosomes, שלפוחית קטנה שנושאות mRNAs, חלבונים, שומנים בדם, ומתווכי miRNAs לתאים המקבלים באמצעות circulat דם המערכתייון 7-14. התוצאה הוא אפנון של ביטוי גנים בתאי נמען ומייצגת מנגנון חדשני של תקשורת סלולרית. לדוגמה, תאים יכולים לווסת את התהליכים חיסונית-רגולציה על ידי הפרשת ו / או exosomes קליטת המכיל מולקולות ביולוגיות מעורבות בדלקת כגון אינטרלויקין 1β (IL1β), נמק גידול גורם-α (TNFα) והפך את גורם גדילה-β5 (TGFβ5), ו את miRNAs המווסת את הגנים האלה 13. כביטוי חריג מירנה הוא תכונה נפוצה במגוון רחב של מחלות בבני אדם, מולקולות אלה מציעות הזדמנויות חדשות ומלהיבות עבור הגילוי והאימות של מטרות טיפוליות חדשניות 2.
miRNAs במחזור נמצא בכל נוזלי גוף וזה ידוע שרכב exosomes שונה המבוסס על תאי המקור שממנו הם שוחררו. לכן הם מציעים השדרה כדי ללמוד את המצב הפיזיולוגי של התאים וכיצד תאי אלתר איתות אפילוTS בתגובה ללחץ, כולל מחלות. לימוד שינויים בהרכב exosome יכול לספק תובנה הולכים אותות ולחקור את פוטנציאל השירות שלהם כסמנים ביולוגיים או מסלולי התערבות טיפוליות.
כאן אנו להדגים את טיהור exosomes ממקורות מרובים המבוססים על פרוטוקולים שפורסמו. exosomes אלה ישמש לבידוד RNA אחרי qPCR לזהות ולמדוד את רמות miRNAs בהווה בexosomes.
בפרוטוקול זה, אנו מראים כימות של miRNAs וmRNAs מexosomes מטוהרים על ידי צנטריפוגה ההפרש מאמצעי תקשורת והתרבות בדם. יש לי Exosomes מרכיבים שונים התלויים מוצאם והם מעורבים במספר תפקודים ביולוגיים, כולל תגובה חיסונית, מצגת אנטיגן, תקשורת תאית, והעברה של רנ"א וחלבונים 9,11,12,19,20.…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי קרנות מריטה אלן מענק קרן לSeena אג'יט. המחברים מבקשים להודות אריקה Balogh וד"ר Soumitra Ghoshroy מאוניברסיטת דרום קרוליינה מרכז מיקרוסקופית אלקטרונים לשימוש מכשיר, סיוע מדעי וטכני.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
Table 1. Table of specific reagents. |