Method Article

배아 배양하는 방법 C. 엘레 셀

DOI:

10.3791/50649

⸱

September 21st, 2013

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans의 유전 및 분자 기술에 쉽게 적용되는 강력한 모델 시스템이다. 최근까지, 비록 세포와 특정 세포 유형의 분리에 대한 직접 액세스를 요구하는 기술은, C.에 적용 할 수 없었다 엘레. 이 제한은 조직이 쉽게 효소 및 / 또는 세제로 처리하여 분해되지 않은 가압 표피 내에 국한된다는 사실 때문이었다. 레어드 꽃, 크리스텐슨과 1 C.을 배양하기위한 강력한 방법을 개발 동료에 의해 ​​초기 개척자의 작업을 바탕으로 큰 규모의 배아 세포 엘레 간스. 계란은 표백제 / NaOH로 처리하여 임신하는 성인에서 분리하고 이후에 달걀 껍질을 제거하는 키틴으로 처리됩니다. 배아 세포는 다음 수동 피펫에 의해 해리와 혈청 풍부한 미디어 기판 덮인 유리에 도금되어있다. 아이솔레이션 셀 24 시간 이내에 형태를 변화시킴으로써 세포를 발현하는 특정 마르크 의해 구별하기 시작할RS. C. 엘레이 방법을 사용하여 배양 된 세포는 체외에서 2 주까지 생존 및 전기 생리학, 면역에 사용 된, 그들은 정렬 및 마이크로 어레이 프로파일에 사용 된 같은 영상도 분석한다.

Introduction

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예쁜 꼬마 선충 (C. elegans의)는 세포 기능 분화 및 동작의 분자 기초를 조사하기위한 강력한 모델 생물이다. 게놈, 신진 대사와 생합성 경로는 척추 동물과 유사하지만, 유전 및 분자 온순함 2 훨씬 크다. 장점 중의 크기와 간단한 해부학, 급속한 수명주기 (25 ° C에서의 3 일), 짧은 수명 (2 개월)과 자손의 많은 수 (> 200)이다. 그것의 자웅 동체 자연과 짧은 수명주기에, 분자 및 유전자 조작은 C로 간단합니다 형질 전환 동물 3,4와 같은 RNA 간섭과 같은 5 유전자 녹다운 기술의 애플리케이션의 생성 등의 elegans. C. 엘레 몸 껍질은 투명합니다. 따라서 세포는 쉽게 성인 및 표준 현미경을 사용하여 난자에 시각화 될 수있다. 지난 40 년 동안, C. 엘레 커뮤니티 C.를위한 귀중한 자원을 만들었습니다 돌연변이, 녹아웃 및 형질 전환의 큰 컬렉션, 신경계 (8)의 전체 복원 등의 해부학과 개발 6,7에 대한 자세한 설명, 잘 주석과 공동체 전체에 사용할 수있는 완전히 시퀀스 게놈 (포함 엘레 조사

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Protocol

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크리스텐슨 등과 비교하여 별표 (*)는 신규 또는 수정 된 단계를 나타냅니다. 1

1. 재질 설정

  1. 세포 배양 과정은 임신하는 인원수로부터 격리 계란 대량을 요구한다. C. 성장한다 계란의 대량 분리하는 박테리아 - 엘레 8P 한천 플레이트에 NA22 (CGC C. elegans의 유전 컨소시엄을 통해 사용 가능)과 시드. 이 판에 사용 펩톤의 양은 일반적으로 NGM 플레이트에 사용되는 8 배의 양입니다. 높은 펩톤 농도 OP50가-두꺼운 층 성장에 반대되는,보다 효율적 NA22 박테리아의 성장을 유지한다.

8P 접시 조리법 :

3g 염화나트륨, 20g 박토 - 펩톤, 30 분간 멸균 및 오토 클레이브의 1 L에 25g의 한천을 녹인다. 55 ° C에서 매체의 열이 식도록 한 후 1 ㎖ 1 MgCl2를 콜레스테롤의 멸균 여과 1 ㎖ (EtOH를 5 ㎎ / ㎖)을 추가,, 망초 1 ㎖ 및 KP 버퍼 (500 ㎖의 재고 : 5g의 K 2 HPO 4,

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Results

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C. 배양 세포가 특정 마커를 차별화하고 표현 세포 엘레

크리스텐슨과 트리 판 블루 염색법을 사용하여 동료는 것을 보여 주었다 배아 C.의> 99 % 엘레 세포는 분리 절차를 생존. 9 일 도금 후 22에서 각각 85 %와 65 %는 여전히 1 살아있다. 고립 된 배아 C. 엘레 세포 분화하기 위하여 기판에 부착한다. 양식 대단히 짧은 시간을 준수하는 데 실패하고 그들이 살아 있는지 명확하지 않다 세포. 세포의 분화 도금 후 2 ~ 3 시간을 시작 ~ 24 시간 동안 계속된다. 24 시간 내, 세포는 특정 형태학에 걸릴. 따라서, 신경이 과정 1,18-20을 보내, 근육 세포는 루멘 (17)을 형성 생체 내 1, 운하 세포에서 볼 수있는 것과 비슷한 손가락 같은 긴 구조를.......

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Discussion

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C. elegans의 개발, 행동과 노화에 관련된 유전자 경로를 해독하기위한 강력한 모델 생물이다. 그것의 편익은 주로이 유전자 조작 할 수있는 용이성에서와 짧은 수명주기에서 유래한다. 의 편의에도 불구하고, C. 엘레는 한계가있다. C.를 엘레 세포는 작은 그러한 마이크로 어레이 분석에 의해 유전자 발현 프로파일과 직접적인 같은 전기 생리학 및 약리학 기술 등 셀에 대한 액세스, 또는 특정 세포 유형의 분리를 요구하는 방법의 적용을 제한하는 가압 표피 내에 갇혀있다. C. elegans의 세포 배양 방법은 본 모델 생물의 많은 한계에 대한 해결책이다.

이 논문에서 우리는 배아 C.를 분리 및 배양에 대한 업데이트 방법을 설명 엘레 대규모의 세포는 크리에 의해 초기 작품을 기반으로 동료 1. 우리 ALSO C.의 생리 학적 과정과 유전 적 요구 .......

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Bacto 펩톤VWR International Inc.90000-382
Difco 한천 과립VWR International Inc.90000-784
Bacto 트립톤VWR International Inc.90000-284
Bacto 효모 추출물VWR International Inc.90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) LiquidInvitrogen11415-064
Fetal Bovine SerumInvitrogen16140-063
페니실린-스트렙토마이신시그마P4333-100ML
스트렙토마이세스 Griseus시그마C6137-25UN
NA22 Escherichia coliCaenorhabditis Genetics Center
Peanut LectinSigmaL0881-10MG
SucroseSigma57903-1KG
D-(+)GlucoseSigma67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin– 틸에테르), N,N,N',N'- 사산(EGTA)시그마E0396-25G
헤페스시그마H3375-500G
콜레스테롤
NaCl시그마57653-1KG
KCl시그마P9333-500G
CaCl2SigmaC1016-500G
MgCl2SigmaM8266-100G
MgSO><4SigmaM2643-500 g
K2HPO4SigmaP2222-500G
KH2PO4SigmaP9791-500G
NaOH시그마S8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
에탄올
고압증기멸균 증류 H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μ l 블루 그래디에이티드 피펫 팁USA Scentific1111-2821
10 ml 멸균 피펫 개별 포장USA Scentific1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μ l) 팁 이젝터가 있는 피펫터VWR International Inc.89079-974
휴대용 피펫 에이드, DrummondVWR International Inc.53498-103
전송 플라스틱 피펫 멸균VWR International Inc.14670-114
15ml 원뿔형 튜브 미국 Scentific1475-1611
50ml 원뿔형 튜브USA Scentific1500-1811
멸균 18 게이지 바늘Becton, Dickinson and Co.
멸균 10ml 주사기Becton, Dickinson and Co.
플라스틱 주사기 필터 Corning 0,20 μ m 기공 크기 Corning431224
Acrodic 25mm 주사기 필터 w/5 μ m versapor 멤브레인VWR International Inc.28144-095
60x15mm 페트리 접시 멸균VWR International Inc.82050-548
100x15mm 페트리 접시 멸균VWR International Inc.82050-912
12mm 직경 유리 커버 슬립VWR International Inc.48300-560
투명 세포 배양 플레이트, 24웰 플랫 바닥(뚜껑 포함Thomas Scientific6902A09
Dumont #5- 미세 집게 Fine Science Tools11254-20
Centrifuge 5702Eppendorf022629883
Laminar Flow Hood
도립 현미경(x10 대물렌즈
주변 공기 가습 인큐베이터
305196305482) 포함)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D.

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