فائقة الدقة التصوير من الخلايا العصبية الحويصلات كثيفة الأساسية
Summary
نحن تصف كيفية تنفيذ photoactivated توطين المجهري (النخيل) القائم على الدراسات من الحويصلات في الخلايا العصبية مثقف الثابتة. المكونات الرئيسية لبروتوكول لدينا تشمل وضع العلامات الحويصلات مع الوهم photoconvertible، وجمع الصور الخام عينات قليلة مع نظام المجهر فائقة القرار، ومعالجة الصور الخام لإنتاج فائقة دقة وضوح الصورة.
Abstract
الكشف عن مضان يوفر الأساس لكثير من التقنيات المستخدمة على نطاق واسع المجهري وتتقدم بسرعة المستخدمة في التطبيقات البيولوجية والطبية الحديثة. وتشمل نقاط القوة في مضان حساسيتها، والنوعية، والتوافق مع التصوير الحي. للأسف، الأشكال التقليدية للمضان المجهري يعانون من الضعف، محدودة حيود قرار رئيسي واحد في الطائرة والتصوير، مما يعوق الدراسات الهياكل ذات أبعاد أصغر من ~ 250 نانومتر. مؤخرا، تم التغلب على هذا القيد مع إدخال تقنيات مضان المجهري فائقة القرار، مثل المجهر photoactivated التعريب (النخيل). على عكس نظيراتها التقليدية، ويمكن PALM تنتج صورا مع قرار الوحشي للعشرات من نانومتر. بالتالي فمن الممكن الآن لاستخدام مضان، مع قوتها لا تعد ولا تحصى، لتوضيح مجموعة من الصفات التي يتعذر الوصول إليها سابقا من الهيكل الخلوي والتنظيم.
_content "> وللأسف، PALM ليست تافهة لتنفيذ، والاستراتيجيات الناجحة في كثير من الأحيان يجب أن يكون متلائما مع نوع النظام تحت الدراسة. في هذه المقالة، وتبين لنا كيفية تنفيذ الدراسات PALM أحادية اللون البنى حويصلي في الخلايا العصبية مثقف ثابت. يعتبر مثاليا النخيل لدراسة الحويصلات، والتي لها أبعاد التي تتراوح عادة من 50-250 نانومتر ~. الخطوات الرئيسية في نهجنا وصفها تشمل الخلايا العصبية مع photoconvertible (الأخضر إلى الأحمر) الوهم من البضائع حويصلة، وجمع الصور الخام عينات قليلة مع نظام المجهري فائقة القرار، ومعالجة الصور الخام لإنتاج صورة عالية الدقة النخيل، ونحن أيضا تدليل على فعالية نهجنا من خلال تقديم صور استثنائية تحل بشكل جيد من الحويصلات كثيفة الأساسية (DCVs) في الخلايا العصبية الحصين مثقف، الذي دحض الفرضية القائلة بأن الاتجار extrasynaptic من DCVs يتم بوساطة حد كبير من قبل مجموعات DCV.Introduction
وهناك عدد من العمليات الخلوية تعتمد على دقة وكفاءة الاتجار حويصلة بوساطة الجزيئات الحيوية إلى وجهات التحت خلوية معينة. أحد الأمثلة البارزة هو التجمع متشابك، والذي يسبقه تراوحت فترة طويلة، بوساطة حويصلة متشابك تسليم المكونة من مواقع نشوء حيوي في سوما العصبية إلى مواقع ما قبل وبعد المشبكي يحتمل القاصي 1.
مضان المجهري هو وسيلة قوية وشعبية لدراسة الاتجار حويصلة. وتشمل نقاط القوة في أسلوب حساسيتها، والنوعية، والتوافق مع التصوير الحي 2. للأسف، حتى وقت قريب نسبيا، فقد عانت هذه التقنية من ضعف رئيسي واحد، القرار محدودة حيود 2، مما يعوق الدراسات الهياكل ذات أبعاد أصغر من ~ 250 نانومتر. مؤخرا، القرار الوحشي في مضان المجهري تجاوزت حاجز الحيود مع الأخذ ميل مضان فائقة القرارتقنيات croscopy، مثل النخيل 3. القرار الوحشي من النخيل، وعشرات من نانومتر، يعتبر مثاليا لدراسة الحويصلات، والتي لها أبعاد التي تتراوح عادة من 50-250 نانومتر ~ 4. بالتالي فمن الممكن الآن لاستخدام مضان، مع قوتها لا تعد ولا تحصى، لتوضيح مجموعة من الصفات التي يتعذر الوصول إليها سابقا من الحويصلات، بما في ذلك بعض جوانب الاتجار بهم إلى مواقع التحت خلوية معينة.
النخيل ليست تافهة لتنفيذ، والاستراتيجيات الناجحة في كثير من الأحيان يجب أن يكون متلائما مع نوع النظام تحت الدراسة. نحن هنا تصف كيفية تنفيذ الدراسات PALM هياكل الحويصلي، وعلينا أن نبرهن على فعالية نهجنا لحالة DCVs في الخلايا العصبية قرن آمون. على وجه الخصوص، ونحن نستخدم النخيل لمعالجة الفرضية القائلة بأن الاتجار DCVs لنقاط الاشتباك العصبي في الخلايا العصبية قرن آمون بوساطة مجموعات DCV 5-8.
الاتجار بوساطة مجموعة من الحويصلات إلى نقاط الاشتباك العصبي في تطوير نeurons هو إمكانية مثيرة للاهتمام لأنها قد تسهل تحقيق الاستقرار متشابك السريع والتجمع 9،10. أنصار الاتجار عنقودية من DCVs الاستشهاد حجم واضحا كبير من نقاط والفلورسنت extrasynaptic إيواء البضائع DCV الخارجية كدليل دعم المجموعات 6. ومع ذلك، تظهر هذه الصور في نقاط والتي تم إنشاؤها باستخدام تقنيات المجهر مضان محدودة الحيود، والتي لا تتناسب مع حجم الآثار الناجمة عن حيود المميزة من تلك التي تنشأ من المجموعات.
لحل هذه المشكلة، جمعنا مضان widefield التقليدية والصور النخيل من الخلايا العصبية الحصين معربا عن الوهم تستهدف DCVs. وكشف تحليل هذه الصور التي> 92٪ من التجمعات المفترضة DCV extrasynaptic في الصور التقليدية يتم حلها إلى 80 نانومتر (الفردية DCV الحجم) 11 نقاط والنخيل في الصور. وبالتالي، فإن هذه البيانات يبطل إلى حد كبير فرضية التكتل كما ينطبق على DCVs في تطوير hippocaالخلايا العصبية mpal.
Protocol
Representative Results
Discussion
ظهرت النخيل وتقنيات الفحص المجهري مضان فائقة الدقة ذات الصلة مؤخرا باعتباره مكملا قيما لأشكال أفضل من تأسيس المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني (EM) 22-24. وتشمل سمات إيجابية من النخيل إعداد نموذج بسيط نسبيا والحد الأدنى من العينة الاضطراب. من حيث المبدأ، PALM يمكن أن ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R15 GM061539 2-02 (لوبا)، 2 R15 NS40425-03 (لJEL)، MH 66179 (الدكتور غاري بانكر أوريغون للصحة والعلوم / OHSU)، وP30 NS061800 (للدكتور سو Aicher من OHSU). نشكر باربرا Smoody للحصول على دعم واسع النطاق مع الثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون، والدكاترة. بريان لونج وجيمس بيلي لقراءة نقدية لهذه المخطوطة.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
References
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. 신경과학. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
