신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징
Summary
우리는 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 기반의 고정, 배양 신경 세포에있는 소포의 연구를 구현하는 방법에 대해 설명합니다. 우리 프로토콜의 주요 구성 요소는 초 해상 현미경 시스템 띄엄 샘플링 된 원시 영상을 수집하고, 수퍼 – 해상도 이미지를 생성하는 것의 이미지를 처리 photoconvertible 키메라와 라벨링 소포를 포함한다.
Abstract
형광 검출 현대 생물학 및 의료 애플리케이션에서 사용 많은 널리 활용하고 신속하게 진행 현미경 기술에 대한 기반을 제공합니다. 형광의 강점은 민감도, 특이도, 라이브 영상과의 호환성이 (가) 있습니다. 불행하게도, 형광 현미경의 전통적인 형태 ~ 250 나노 미터보다 작은 크기와 구조의 연구를 방해 영상 평면에서 하나의 주요 약점, 회절 제한 해상도에서 고통. 최근, 이러한 제한은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM)와 같은 초 고해상도 형광 현미경 기술의 도입으로 극복하고있다. 는 기존의 대응과는 달리, PALM은 수십 나노 미터의 측면 해상도로 이미지를 생성 할 수 있습니다. 그것은 세포의 구조 및 조직의 이전에 액세스 할 수없는 속성의 스펙트럼을 설명하기 위하여, 그것의 수많은 장점과 함께, 형광을 사용하는 지금 이렇게 할 수 있습니다.
_content "> 불행히도, PALM 구현하기 간단하지 않습니다, 그리고 성공 전략은 종종 연구중인 시스템의 유형에 맞게 조정해야합니다.이 문서에서는, 우리는 고정 된 배양 된 신경 세포의 기공을 갖는 구조의 단일 색상 PALM 연구를 구현하는 방법을 보여줍니다. PALM은 이상적으로 50 ~ 250 nm의 ~에서. 우리의 접근의 주요 단계를 포함 일반적으로 범위 치수가 소포의 연구에 적합와 간헐적 샘플링 RAW 이미지를 수집, photoconvertible (빨강 녹색) 소포화물의 키메라와 신경 세포를 라벨 수퍼 – 해상도 현미경 시스템, 고해상도 PALM 화상을 생성하는 것의 이미지를 처리. 또한 반박되는 배양 된 해마 뉴런 고밀도 코어 소포 매우 잘 해결 이미지 (DCVs)을 제시하여 우리의 접근 방법의 효능을 입증 DCVs의 extrasynaptic 매매는 DCV 클러스터에 의해 주로 매개되는 가설.Introduction
세포 프로세스의 숫자는 특정 세포 내 목적지로 생체 분자의 정확하고 효율적인 소포 – 중재 인신 매매에 따라 달라집니다. 한 가지 눈에 띄는 예는 잠재적으로 말초 사전 및 시냅스 사이트 1에 신경 소마의 생합성의 사이트에서 시냅스 성분의 긴 원거리, 소포 – 중재 배달로 시작되는 시냅스 어셈블리입니다.
형광 현미경 소포 인신 매매를 공부 강력하고 인기있는 방법입니다. 기술의 강점은 민감도, 특이도, 라이브 영상 2와 호환이 (가) 있습니다. 불행하게도, 비교적 최근까지,이 기술은 ~ 250 나노 미터보다 작은 크기와 구조의 연구를 방해 한 가지 큰 약점, 회절 제한 해결 방법 2, 고통했다. 최근, 형광 현미경의 측 방향 해상도 초해 형광 미시간의 도입으로 회절 장벽을 능가같은 PALM 3과 croscopy 기술. PALM의 측면 해상도는, 수십 나노 미터는 적으로 일반적으로 50 ~ 250 nm의 4 ~ 범위 치수가 소포의 연구에 적합합니다. 그것은 특정 세포 내 사이트에 자신의 인신 매매의 몇 가지 측면을 포함하여 소포의 이전에 액세스 할 수없는 특성의 스펙트럼을 설명하기 위하여, 그것의 수많은 장점과 함께, 형광을 사용하는 지금 이렇게 할 수 있습니다.
PALM 구현하기가 간단하지 않습니다, 그리고 성공 전략은 종종 연구중인 시스템의 유형에 맞게 조정해야합니다. 여기에서 우리는 기공을 갖는 구조의 PALM 연구를 구현하는 방법을 설명하고, 우리는 해마 신경 세포에있는 DCVs의 경우에 대한 우리의 접근 방식의 효과를 보여줍니다. 특히, 우리는 해마 신경 세포의 시냅스에 가설에게 DCVs의 인신 매매를 해결하기 위해 PALM를 사용은 DCV 클러스터 5-8에 의해 매개된다.
N 개발에 시냅스 소포의 클러스터 매개 매매그것은 빠른 시냅스 안정화 및 조립 9,10을 용이하게 할 수 있기 때문에 eurons는 흥미로운 가능성이다. DCVs의 클러스터 인신 매매의 지지자들은 클러스터링 6을 지원하는 증거로 외인 DCV화물을 품고 extrasynaptic 형광 puncta에의 큰 외관상의 크기를 인용. 그러나 이러한 puncta에 클러스터링에서 발생하는 것과 회절에서 발생하는 구별 크기 효과에 적합하지 않습니다 회절 제한 형광 현미경 기술을 사용하여 생성 된 이미지에 나타납니다.
이 문제를 해결하기 위해, 우리는 기존의 위드 형광 및 DCVs을 대상으로 키메라를 표현하는 해마 신경 세포의 PALM 이미지를 수집. 이러한 이미지의 분석은 기존의 이미지에서 추정 extrasynaptic DCV 클러스터의> 92 %, 80 nm의 PALM 이미지에서 (개인 DCV 크기) 11 puncta에로 해결되는 것으로 나타났다. hippoca 개발 DCVs에 적용 따라서, 이들 데이터는 큰폭 클러스터링 가설 무효화mpal 신경.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM 및 관련 최고 해상도의 형광 현미경 기술은 최근 광학 현미경과 전자 현미경 (EM) 22 ~ 24의 잘 확립 된 형태의 귀중한 보완 등장했습니다. PALM의 긍정적 인 특성은 비교적 간단한 샘플 준비 최소한의 샘플 섭동 (perturbation)이 (가) 있습니다. 원칙적으로, PALM는 살아있는 세포를 연구 할 수있다. 아마 PALM의 주요 음의 속성은 크게 살아있는 세포에 빠르게 동적 프로세스의 연구를 방해 시간이…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은, (BAS에) 2 R15 GM061539-02을 부여 (JEL에) 2 R15 NS40425-03, MH 66179 (오레곤 보건 과학 대학 / OHSU 박사 게리 은행에)는 건강의 국립 연구소에 의해 지원하고, P30했다 NS061800 (OHSU의 박사 슈 아이 허에). 우리는 해마 신경 세포의 문화에 광범위한 지원을위한 바바라 Smoody 감사합니다, 박사 부부. 이 원고의 중요한 읽기 브라이언 긴 제임스 아브 네이.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
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