Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme
Summary
Biz fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM)-tabanlı sabit, kültürlü nöronlar kesecikler çalışmaları nasıl uygulanacağını açıklar. Bizim protokol anahtar bileşenleri süper çözünürlüklü mikroskopi sistemi ile seyrek örneklenmiş ham görüntüleri toplamak ve bir süper-çözünürlük görüntü üretmek için ham görüntüleri işlerken photoconvertible kimeralar ile etiketleme veziküller içerir.
Abstract
Floresan tespiti, modern biyolojik ve tıbbi uygulamalarda kullanılan birçok yaygın olarak kullanılan ve hızla ilerleyen mikroskopi teknikleri için temel sağlar. Floresan güçlü, duyarlılık, özgüllük, ve canlı görüntüleme ile uyumluluk içerir. Ne yazık ki, floresan mikroskopi geleneksel formları ~ 250 nm daha küçük boyutlara sahip yapıların çalışmalarını engellemektedir görüntüleme düzlemde önemli bir zayıflık, kırınım-sınırlı çözünürlük, muzdarip. Son zamanlarda, bu tür sınırlama fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) olarak süper çözünürlüklü floresan mikroskopi teknikleri, tanıtımı ile aşılmıştır. Geleneksel muadillerine aksine, PALM nanometre onlarca yanal çözünürlükte görüntüler üretebilir. Bu hücresel yapı ve organizasyon önce ulaşılmaz özellikleri bir spektrum aydınlatmak için, sayısız güçlü olan, floresan kullanmak artık mümkün olmaktadır.
_content "> Maalesef, PALM uygulamak için önemsiz değildir ve başarılı stratejiler genellikle çalışmanın altında sisteminin türüne uygun olmalıdır. Bu yazıda, sabit, kültürlü nöronlar veziküler yapıların tek renk PALM çalışmaları nasıl uygulanacağını göstermektedir. PALM ideal 50-250 nm ~ dan. yaklaşımımızda Temel adımlar şunlardır tipik aralığı boyutları veziküllerden çalışmaya uygun bir ile seyrek örneklenmiş ham görüntüleri toplama, photoconvertible (kırmızı yeşil) vezikül kargo kimeralardır nöronları etiketleme süper çözünürlük mikroskopi sistemi ve yüksek çözünürlüklü PALM görüntü üretmek için ham görüntü işleme. Biz de çürütmek, hangi kültüre hipokampal nöronlar yoğun çekirdekli kesecikler derece iyi çözüme görüntüleri (DCVs) sunarak bizim yaklaşımın etkinliğini göstermek DCVs arasında extrasynaptic kaçakçılığı AEOV kümeleri büyük ölçüde aracılık ettiğini hipotezi.Introduction
Hücresel süreçlerin bir dizi özel subsellüler noktaya biyomoleküllerin doğru ve verimli vezikül aracılı kaçakçılığı bağlıdır. Bir önemli örnek potansiyel distal pre-ve postsinaptik sitelere 1 nöronal soma içinde biyotekvinin sitelerinden sinaptik bileşenlerin uzun menzilli, vezikül aracılı teslimat öncesinde, hangi sinaptik montaj olduğunu.
Floresan mikroskopi vezikül kaçakçılığı okuyan güçlü ve popüler bir yöntemdir. Tekniği güçlü, duyarlılık, özgüllük, ve canlı görüntüleme 2 ile uyumluluğu gibi. Ne yazık ki, yakın zamana kadar, teknik ~ 250 nm daha küçük boyutlara sahip yapıların çalışmalarını engellemektedir önemli bir zayıflık, kırınım-sınırlı çözünürlük 2, zarar gördü. Son zamanlarda, floresan mikroskobu lateral çözünürlük süper çözünürlüklü floresan mi getirilmesi ile kırılma engelini aştıBöyle PALM 3 gibi croscopy teknikleri. PALM yanal çözünürlüğü, nanometre on, ideal olarak genelde ~ 50-250 nm 4 arasında değişen boyutlara sahip veziküller, çalışma için uygundur. Bu, belirli bir hücre içi sitelerine ticareti bazı yönlerini de dahil olmak üzere, daha önce veziküllerin erişilemez özellikleri, bir spektrum aydınlatmak için, sayısız güçlü olan, floresan kullanmak artık mümkün olmaktadır.
PALM uygulamak için önemsiz değildir ve başarılı stratejiler genellikle çalışmanın altında sisteminin türüne uygun olmalıdır. Burada veziküler yapıların PALM çalışmaları nasıl tanımlamak, ve biz hipokampal nöronlarda DCVs durumunda bizim yaklaşımın etkinliğini göstermek. Özellikle, biz hipokampal nöronlar sinaps hipotezi DCVs bu ticaretiyle mücadele için PALM kullanmak AEOV kümeleri 5-8 aracılık eder.
N gelişmekte sinaps veziküllerin Küme aracılı ticaretibu hızlı sinaptik istikrar ve montaj 9,10 kolaylaştırabilir çünkü eurons ilginç bir olasılıktır. DCVs kümelenmiş kaçakçılığı savunucuları kümeleme 6 destekleyen kanıt olarak eksojen AEOV kargo barındıran extrasynaptic floresan punktumlarda büyük görünen boyutunu öngörmektedirler. Ancak, bu puncta kümeleme kaynaklanan olanlardan difraksiyonuyla kaynaklanan ayırt edici boyutu etkilerine uygun değildir kırınım-sınırlı floresan mikroskopi teknikleri kullanılarak oluşturulan görüntülerde.
Bu sorunu çözmek için, biz konvansiyonel widefield floresan ve DCVs hedefleyen kuruntulardan ifade hipokampalinden PALM görüntülerini topladı. Bu görüntülerin analiz konvansiyonel görüntülerde varsayılan extrasynaptic AEOV kümelerin> 92% 80 nm PALM görüntüleri (bireysel DCV-ölçekli) 11 puncta olarak çözülmesi olduğunu ortaya çıkardı. Hippoca gelişmekte DCVs uygulanan Bu nedenle, bu veriler, büyük ölçüde kümelenme hipotezi geçersizMPAL nöronlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM ve ilgili süper çözünürlüklü floresan mikroskopi teknikleri son zamanlarda optik ve elektron mikroskopi (EM) 22-24 daha iyi yerleşmiş biçimlerine değerli bir tamamlayıcısı olarak ortaya çıkmıştır. PALM olumlu nitelikleri nispeten basit örnek hazırlama ve minimal örnek sarsımına içerir. İlke olarak, aynı zamanda oturma PALM hücreleri incelemek için kullanılabilir. Muhtemelen PALM temel olumsuz özelliği belirgin canlı hücreler daha hızlı dinamik süreçlerin çalışmala…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, (BAS) 2 R15 GM061539-02 hibe (JEL) 2. R15 NS40425-03, MH 66179 (Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi / OHSU Dr Gary Banker) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen ve P30 edildi NS061800 (OHSU Dr Sue Aicher için). Biz hipokampalinden kültürü ile geniş destek için Barbara Smoody teşekkür ve Dr. Bu yazının bir eleştirel okuma Brian Uzun ve James Abney.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
References
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. 신경과학. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
