Super-résolution d'imagerie de neurones vésicules à cœur dense
Summary
Nous décrivons comment mettre en œuvre photoactivée microscopie localisation (PALM) à base des études de vésicules dans fixes, des neurones en culture. Les éléments clés de notre protocole comprennent l'étiquetage des vésicules avec des chimères photoconvertible, la collecte des images brutes faiblement échantillonnées avec un système de microscopie de super-résolution, et de traitement des images brutes afin de produire une image de super-résolution.
Abstract
Détection de la fluorescence fournit la base pour de nombreuses techniques de microscopie largement utilisés et les progrès rapides utilisés dans des applications biologiques et médicales modernes. Points forts de fluorescence comprennent la sensibilité, la spécificité et la compatibilité avec l'imagerie en direct. Malheureusement, les formes classiques de la microscopie de fluorescence souffrent d'une faiblesse, une résolution limitée par la diffraction principal dans le plan de formation d'image, ce qui entrave les études de structures ayant des dimensions inférieures à ~ 250 nm. Récemment, cette limitation a été surmontée avec l'introduction de super-résolution des techniques de microscopie de fluorescence, comme la microscopie de localisation photoactivée (PALM). Contrairement à ses homologues conventionnels, PALM peut produire des images avec une résolution latérale de quelques dizaines de nanomètres. Il est donc maintenant possible d'utiliser la fluorescence, avec ses forces multiples, pour élucider un spectre d'attributs précédemment inaccessibles de la structure cellulaire et de l'organisation.
_content "> Malheureusement, PALM n'est pas trivial à mettre en œuvre, et des stratégies efficaces doit souvent être adapté au type de système à l'étude. Dans cet article, nous montrons comment mettre en œuvre une seule couleur études de paume de structures vésiculaires dans des neurones cultivés fixes. PALM est idéalement adapté à l'étude de vésicules, qui ont des dimensions qui vont généralement de ~ 50-250 nm. étapes clés de notre approche comprennent l'étiquetage des neurones avec photoconvertible (du vert au rouge) chimères de fret de la vésicule, la collecte des images brutes faiblement échantillonnées avec un système de microscopie de super-résolution, et le traitement des images brutes afin de produire une image de PALM haute résolution. Nous démontrons également l'efficacité de notre approche en présentant des images exceptionnellement bien résolus de vésicules à cœur dense (VJC) dans les neurones d'hippocampe en culture, qui réfute l'hypothèse que le trafic extrasynaptique de VJCs est médiée principalement par les pôles de DCV.Introduction
Un certain nombre de processus cellulaires dépendent de trafic précis et efficace des vésicules médiée par des biomolécules sous-cellulaires à des destinations spécifiques. Un exemple frappant est l'assemblage synaptique, qui est précédé par une longue-distance, la livraison des vésicules synaptiques à médiation des constituants à partir de sites de la biogenèse du soma neuronal de sites pré-et post-synaptiques potentiellement distales 1.
La microscopie à fluorescence est une méthode puissante et populaire d'étudier le trafic vésiculaire. Points forts de la technique sont sa sensibilité, la spécificité, et la compatibilité avec l'imagerie en direct 2. Malheureusement, jusqu'à relativement récemment, la technique a souffert d'une faiblesse majeure, la résolution limitée par la diffraction 2, ce qui entrave les études de structures avec des dimensions inférieures à ~ 250 nm. Récemment, la résolution latérale en microscopie à fluorescence a dépassé la barrière de diffraction avec l'introduction de mi de fluorescence super-résolutiontechniques croscopy, tels que PALM 3. La résolution latérale de PALM, des dizaines de nanomètres, est idéalement adapté à l'étude de vésicules, qui ont des dimensions qui vont généralement de ~ 50-250 nm 4. Il est donc maintenant possible d'utiliser la fluorescence, avec ses forces multiples, pour élucider un spectre d'attributs précédemment inaccessibles de vésicules, y compris certains aspects de leur trafic vers les sites sous-cellulaires spécifiques.
PALM n'est pas trivial à mettre en œuvre, et des stratégies efficaces doit souvent être adapté au type de système à l'étude. Nous décrivons ici comment mettre en œuvre des études paume de structures vésiculaires, et nous démontrons l'efficacité de notre approche pour le cas de VJCs dans les neurones de l'hippocampe. En particulier, nous utilisons PALM à vérifier l'hypothèse que le trafic de VJCs de synapses dans les neurones de l'hippocampe est médiée par les pôles de DCV 5-8.
trafic de cluster médiation de vésicules de synapses dans le développement de neurons est une possibilité intéressante, car elle peut faciliter la stabilisation synaptique rapide et assemblage 9,10. Les partisans de la traite cluster de VJCs citent la taille apparente de puncta fluorescent extrasynaptique hébergement fret DCV exogène comme preuve à l'appui regroupement 6. Toutefois, ces points lacrymaux apparaissent dans les images générées en utilisant des techniques de microscopie de fluorescence diffraction limitée, qui ne sont pas adaptés à des effets de taille marquantes émanant diffraction de ceux découlant de clustering.
Pour résoudre ce problème, nous avons recueilli de fluorescence à champ large classique et images paume de neurones de l'hippocampe exprimant des chimères ciblées à VJCs. L'analyse de ces images a révélé que> 92% de présumés groupes de DCV extrasynaptiques en images classiques sont résolus 80 nm (DCV taille individuelle) 11 points lacrymaux en images PALM. Ainsi, ces données invalident largement l'hypothèse de regroupement tel qu'il est appliqué à l'élaboration VJCs hippocaneurones MPAL.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM et des techniques de microscopie de fluorescence super-résolution connexes ont récemment émergé comme un complément précieux aux formes les mieux établies de la microscopie optique et la microscopie électronique (EM) 22-24. Attributs positifs de PALM comprennent la préparation de l'échantillon relativement simple et l'échantillon minimal perturbation. En principe, PALM peut également être utilisé pour étudier des cellules vivantes. Probablement le principal attribut négatif de PAL…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde 2 R15 GM061539-02 (à BAS), 2 R15 NS40425-03 (à JEL), MH 66179 (Dr Gary banquier de l'Oregon Health & Science University / OHSU), et P30 NS061800 (Dr Sue Aicher de OHSU). Nous remercions Barbara Smoody pour un large soutien à la culture de neurones de l'hippocampe, et les Drs. Brian Long et James Abney pour une lecture critique de ce manuscrit.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
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