Супер-Resolution Imaging нейронных Плотные-ядерные пузырьков
Summary
Опишем, как реализовать фотоактивируемые локализации микроскопии (PALM) на основе исследования пузырьков в основной, культивируемых нейронов. Ключевые компоненты нашего протокола включают маркировки пузырьки с photoconvertible химер, собирая редко выборочные необработанных изображений с системой микроскопии сверхвысокого разрешения, и обработка исходных изображения на продукцию супер-разрешение изображения.
Abstract
Обнаружение флуоресценции обеспечивает основу для многих широко используемых и быстро развивающихся методов микроскопии, занятых в современных биологических и медицинских приложений. Сильные флуоресценции включают его чувствительности, специфичности и совместимость с живого изображения. К сожалению, обычные формы флуоресцентной микроскопии страдают от одного крупного слабость, разрешение дифракционной в плоскости изображения, что затрудняет исследования структур с размерами, меньшими, чем ~ 250 нм. В последнее время это ограничение было преодолеть с введением методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, таких как фотоактивируемой локализации микроскопии (PALM). В отличие от своих обычных аналогов, PALM может создавать изображения с пространственным разрешением в десятки нанометров. Таким образом, теперь можно использовать флуоресценцию, с его бесчисленными сильные стороны, чтобы пролить свет на спектр ранее недоступных атрибутов клеточной структуры и организации.
_content "> К сожалению, PALM не является тривиальной в реализации, и успешные стратегии часто должны быть адаптированы к типу изучаемой системы. В этой статье мы покажем, как реализовать одноцветных PALM исследования везикулярного структур на рынке фиксированных, культивируемых нейронов. PALM идеально подходит для изучения пузырьков, которые имеют размеры, которые, как правило, варьируются от ~ 50-250 нм. Ключевые шаги в нашем подходе включают маркировки нейронов с photoconvertible (зеленый на красный) химеры пузырьков груза, собирая редко выборочные необработанных изображений с Система микроскопии супер-разрешения и обработки необработанных изображений с целью выработать PALM изображение высокого разрешения. Мы также продемонстрировать эффективность нашего подхода, представляя исключительно хорошо решены образы плотной основных пузырьков (DCVS) в культивируемых нейронах гиппокампа, которые опровергают гипотеза, что extrasynaptic торговля DCVS опосредуется в основном DCV кластеров.Introduction
Ряд клеточных процессов зависит от точного и эффективного везикул-опосредованной торговли биомолекул на конкретные субклеточных направлений. Один из ярких примеров является синаптической собрание, которое предшествует долго колебался, везикул-опосредованной доставки синаптических компонентов из сайтов биогенеза в нейронной сомы к потенциально дистальных пред-и постсинаптических участках 1.
Флуоресцентная микроскопия является мощным и популярным методом изучения торговлей пузырьков. Сильные стороны метода относятся его чувствительность, специфичность и совместимость с живого изображения 2. К сожалению, до сравнительно недавнего времени, техника не пострадал от одного из основных недостатков, дифракционной разрешением 2, что затрудняет исследования структур с размерами, меньшими, чем ~ 250 нм. Недавно, боковая разрешение в флуоресцентной микроскопии превзошел дифракции барьер с введением флуоресценции ми супер-разрешениямикроскопия методы, такие как PALM 3. Боковое разрешение PALM, десятки нанометров, идеально подходит для изучения пузырьков, которые имеют размеры, которые, как правило, варьируются от ~ 50-250 нм 4. Таким образом, теперь можно использовать флуоресценцию, с его бесчисленными сильные стороны, чтобы пролить свет на спектр ранее недоступных атрибутов пузырьков, в том числе некоторые аспекты их торговли на конкретные субклеточных сайтов.
PALM не является тривиальной в реализации, и успешные стратегии часто должны быть адаптированы к типу исследуемой системы. Здесь мы опишем, как реализовать исследований ладони везикулярного структур, и мы продемонстрировать эффективность нашего подхода для случая DCVS в нейронах гиппокампа. В частности, мы используем PALM обратиться гипотезу, что торговля DCVS чтобы синапсов в нейронах гиппокампа опосредуется DCV кластеров 5-8.
Кластер-опосредованной торговля пузырьков в синапсах в развивающихся пeurons является интригующая возможность, потому что это может способствовать скорейшей стабилизации синапсов и сборку 9,10. Сторонники кластерного торговли DCVS привести большой видимый размер extrasynaptic флуоресцентного Puncta укрывательство экзогенный DCV груз как доказательств, подтверждающих кластеризации 6. Однако эти Puncta На изображениях появляются генерируемых с помощью дифракционной флуоресценции методы микроскопии, которые не подходят для отличительных размерных эффектов, возникающих от дифракции от тех, которые вызваны кластеризации.
Чтобы решить эту проблему, мы собрали обычную флуоресценции широким полем зрения и пальмовое образы нейронов гиппокампа, выражающих химеры, ориентированные на DCVS. Анализ этих изображений показал, что> 92% предполагаемых extrasynaptic кластеров DCV в обычных изображений решаются как 80 нм (индивидуальное DCV размера) 11 Puncta в Палм-изображений. Таким образом, эти данные в значительной степени недействительным кластеризации гипотезу применительно к DCVS в разработке hippocampal нейроны.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM и связанные флуоресценции методы микроскопии сверхвысокого разрешения в последнее время появились в качестве ценного дополнения к лучше-установленным формам оптической микроскопии и электронной микроскопии (ЭМ) 22-24. Положительные атрибуты PALM включают относительно простой ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья предоставляет 2 R15 GM061539-02 (для BAS), 2 R15 NS40425-03 (в JEL), MH 66179 (доктора Гэри банкир Oregon Health & Science University / OHSU) и P30 NS061800 (доктора Сью Aicher из OHSU). Мы благодарим Барбара Smoody за всестороннюю поддержку с культурой нейронов гиппокампа, и доктора. Брайан Лонг и Джеймс Abney для критического прочтения этой рукописи.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
References
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. 신경과학. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
