Super-resolución de imagen de Neuronales vesículas de núcleo denso
Summary
Se describe cómo implementar la localización microscopía fotoactivado (PALM) basado en estudios de vesículas en las neuronas cultivadas, fijos. Los componentes clave de nuestro protocolo de etiquetado incluyen vesículas con quimeras fotoconvertible, recogiendo imágenes crudas escasamente muestreados con un sistema de microscopia de super-resolución, y el procesamiento de las imágenes en bruto para producir una imagen de super-resolución.
Abstract
La detección de la fluorescencia proporciona la base para muchas de las técnicas de microscopía ampliamente utilizados y rápido avance de empleados en las aplicaciones biológicas y médicas modernas. Fortalezas de la fluorescencia son su sensibilidad, especificidad, y la compatibilidad con imágenes en vivo. Desafortunadamente, las formas convencionales de microscopía de fluorescencia sufren de una debilidad importante, la resolución de difracción limitada en el plano de la imagen, lo que dificulta los estudios de estructuras con dimensiones menores que ~ 250 nm. Recientemente, esta limitación ha sido superada con la introducción de técnicas de microscopía de fluorescencia de super-resolución, como la microscopía de localización fotoactivado (PALM). A diferencia de sus contrapartes convencionales, PALM puede producir imágenes con una resolución lateral de decenas de nanómetros. Por lo tanto, es ahora posible usar la fluorescencia, con sus puntos fuertes miríada, para aclarar un espectro de atributos previamente inaccesibles de estructura celular y organización.
_content "> Lamentablemente, PALM no es trivial de implementar, y estrategias de éxito a menudo se debe adaptar al tipo de sistema en estudio. En este artículo, mostramos cómo implementar estudios PALM solo color de estructuras vesiculares en neuronas cultivadas, fijos. PALMA es ideal para el estudio de las vesículas, que tienen dimensiones que suelen oscilar entre ~ 50-250 nm. Pasos clave en nuestro enfoque de incluir el etiquetado de las neuronas con fotoconvertible (verde a rojo) quimeras de la carga de la vesícula, la recogida de imágenes en bruto escasamente muestreados con un sistema de microscopia de super-resolución, y el procesamiento de las imágenes en bruto para producir una imagen de alta resolución PALMA. También demuestran la eficacia de nuestro enfoque mediante la presentación de imágenes excepcionalmente bien resueltas de vesículas de núcleo denso (DCVS) en las neuronas del hipocampo en cultivo, lo que refuta la hipótesis de que la trata de extrasynaptic DCVs está mediada en gran parte por grupos DCV.Introduction
Un número de procesos celulares dependen de tráfico de vesículas mediada precisa y eficiente de biomoléculas a destinos subcelulares específicos. Un ejemplo destacado es la asamblea sináptica, que está precedida por oscilado largo la entrega, mediada por vesículas sinápticas de los constituyentes de los sitios de la biogénesis del soma neuronal potencialmente distales sitios pre y postsinápticos 1.
La microscopia de fluorescencia es un método poderoso y popular de estudiar el tráfico de vesículas. Fortalezas de la técnica son su sensibilidad, especificidad, y la compatibilidad con imágenes en vivo 2. Por desgracia, hasta hace relativamente poco, la técnica ha sufrido de una gran debilidad, la resolución de difracción limitada 2, lo que dificulta los estudios de estructuras con dimensiones menores que ~ 250 nm. Recientemente, la resolución lateral en microscopía de fluorescencia superó la barrera de difracción con la introducción de super-resolución de fluorescencia millastécnicas de microscopía, como la palma 3. La resolución lateral de PALMA, decenas de nanómetros, es ideal para el estudio de las vesículas, que tienen dimensiones que suelen oscilar entre ~ 50-250 nm 4. Por lo tanto, es ahora posible usar la fluorescencia, con sus puntos fuertes miríada, para aclarar un espectro de atributos previamente inaccesibles de vesículas, incluyendo algunos aspectos de su tráfico a sitios subcelulares específicos.
PALMA no es trivial de implementar, y estrategias de éxito a menudo se debe adaptar al tipo de sistema en estudio. Aquí se describe cómo implementar estudios de palma de estructuras vesiculares, y se demuestra la eficacia de nuestro enfoque para el caso de DCVs en las neuronas del hipocampo. En particular, utilizamos PALMA hacer frente a la hipótesis de que la trata de DCVs de sinapsis en las neuronas del hipocampo está mediada por grupos DCV 5-8.
Tráfico Cluster mediada por vesículas de las sinapsis en el desarrollo de neurons es una posibilidad intrigante, ya que puede facilitar la estabilización sináptica rápida y montaje de 9,10. Los defensores de la trata agrupada de DCVs citan el gran tamaño aparente de puntos lagrimales fluorescente extrasynaptic albergar carga DCV exógena como la evidencia que soporta clustering 6. Sin embargo, estos puntos lagrimales aparecen en las imágenes generadas usando técnicas de microscopía de fluorescencia de difracción limitada, que no se adaptan a efectos de tamaño distintivas derivados de difracción de los derivados de la agrupación.
Para resolver este problema, hemos recogido la fluorescencia de campo amplio convencional y las imágenes palma de las neuronas del hipocampo expresan quimeras dirigidos a DCVs. El análisis de estas imágenes reveló que> 92% de los racimos DCV extrasinápticos putativos en imágenes convencionales se resuelven como 80 nm (DCV tamaño individual) 11 puntos lagrimales en imágenes PALMA. Por lo tanto, estos datos invalidan en gran medida la hipótesis de la agrupación como se aplica a DCVs en el desarrollo de hippocaneuronas Mpal.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALMA y técnicas de microscopía de fluorescencia de super-resolución relacionados han surgido recientemente como un valioso complemento de las formas más establecidas de la microscopía óptica y microscopía electrónica (EM) 22-24. Los atributos positivos de la palma incluyen la preparación de muestras relativamente simple y mínima perturbación de la muestra. En principio, Palm también se puede utilizar para estudiar las células de vida. Probablemente el principal atributo negativo de palma es la a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 2 R15 GM061539-02 (a BAS), 2 R15 NS40425-03 (a JEL), MH 66179 (con el Dr. Gary Banquero de la Oregon Health & Science University / OHSU) y P30 NS061800 (Dr. Sue Aicher de OHSU). Damos las gracias a Barbara Smoody para una amplia compatibilidad con la cultura de las neuronas del hipocampo, y los Dres. Brian Long y James Abney para una lectura crítica de este manuscrito.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
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