Summary
Fremgangsmåder er beskrevet til tyndtlags kromatografi (TLC) adskillelse af planteekstrakter og kontakt bioautografi til at identificere antibakterielle metabolitter. De metoder, der anvendes til screening af rødkløver phenolforbindelser inhiberer hyper ammoniak-producerende bakterier (HAB) er native for bovin vommen.
Abstract
En fælles skærm for vegetabilske antimikrobielle forbindelser består af adskillelse planteekstrakter af papir eller tyndtlagskromatografi (PC eller TLC), udsætter kromatogrammerne mikrobielle suspensioner (f.eks svampe eller bakterier i bouillon eller agar), giver tid til mikroorganismerne til at vokse i et fugtigt miljø, og visualisere zoner uden mikrobiel vækst. Effektiviteten af denne screeningsmetode, der er kendt som bioautografi, afhænger både kvaliteten af kromatografisk separation og omhu med mikrobielle dyrkningsbetingelser. Dette papir beskriver standard protokoller for TLC og kontakt bioautografi med en roman ansøgning til aminosyre-gærende bakterier. Ekstrakten separeres på fleksible (aluminium-backed) silica TLC-plader, og bands visualiseres under ultraviolet lys (UV). Zoner er skåret ud og inkuberes med forsiden nedad på agar podet med test mikroorganisme. Inhiberende bånd visualiseret ved farvning agarpladens med tetrazolium rød. Metoden anvendes til adskillelse af rødkløver (Trifolium pratense cv. Kenland) phenolforbindelser og deres screening for aktivitet mod Clostridium sticklandii, en hyper ammoniak-producerende bakterie (HAB), som er hjemmehørende i den bovine vommen. TLC metoder gælder for mange typer planteekstrakter og andre bakteriearter (aerobe eller anaerobe), samt svampe, kan anvendes som testorganismer hvis dyrkningsbetingelserne er modificeret til at passe til kravene i de arter vækst.
Introduction
Analyse for antimikrobielle forbindelser i planter kræver separering af komponenter i en planteekstrakt, udsætter en test mikroorganisme disse komponenter, og bestemme, hvorvidt mikroorganismen vækst er hæmmet af nogen af forbindelserne. Separationer af papir eller tyndtlagskromatografi (PC eller TLC) er praktisk, fordi mange forbindelser kan adskilles på en plan overflade. Adskillelse er baseret på polaritet, med nogle forbindelser binder tæt til adsorbent (cellulose, i tilfælde af PC, og en række adsorbenter i tilfælde af TLC) og overførslen mindre end andre 1. Figur 1 viser et eksempel på de relative positioner af polære og upolære phenolforbindelser efter separation på en silica-TLC-plade.
Figur 1. Diagram, der viser fordelingen af forbindelser med forskellige polariteter efter adskillelse på silicagel tyndtlagskromatografisk (TLC) plade. Phenolforbindelser af rødkløver (Trifolium pratense L.) anvendes som et eksempel. Polære forbindelser, såsom clovamide, har en stærk affinitet for en polær adsorbent som silica og forblive nær oprindelse (OR), mens mindre polære forbindelser, såsom de tre isoflavoner nær opløsningsmiddelfronten (SF), partition lettere i opløsningsmidler (som er mindre polære end silica medmindre vand, syrer eller baser er inkluderet) og migrere længere op pladen.
Efter adskillelse af et uddrag på en TLC-plade, kan forsøgsmikroorganismer blive udsat for alle forbindelser på pladen, og dermed fremskynde identifikation af de aktive komponenter i en ekstrakt 2. Hvis en svampe-eller bakteriel kultur udsættes for kromatogrammet, vil mikrobiel vækst forekomme overalt, undtagen i områder med vækst-inhibitory forbindelser. Hæmningszoner så kan visualiseres ved at observere kontrasten mellem mycelievækst og den vækst-fri områder, hvis svampe er blevet anvendt 3 eller ved sprøjtning med forbindelser, der skifter farve når det reduceres eller hydrolyseret af levende celler 4.. Selv om brugen af papir eller tyndtlagschromatogrammer for antimikrobielle assays først blev anvendt antibiotika 5 og fungicider 3,6, er planteekstrakter nu ofte screenes for antimikrobielle stoffer med denne metode, der ofte omtales som bioautografi. De beskrevne protokoller heri gælder bioautografi af tyndtlagschromatogrammer. TLC er almindeligt anvendt, fordi det er relativt hurtig og kan udføres på forskellige adsorbenter (fx silica, stivelse, alumina), såvel som giver god opløsning og følsomhed 1.
Planteekstrakter kan fremstilles til TLC på mange måder. Almindelige metoder er bl.a. udvinder plantemateriale alcohol-vand-blandinger, såsom 80% ethanol 7,8, eventuelt med tilsætning af syre eller base 9. Efter ekstraktion i sådanne opløsningsmidler, som indeholder noget vand, og som muligvis er sur eller basisk, skal ekstrakter koncentreres, så de kan anvendes til TLC-plader i et minimalt volumen. Koncentrationen af vand og alkohol ekstrakter kan opnås ved at opdele med vand ikke-blandbare organiske opløsningsmidler 8 eller med en blanding af sådanne opløsningsmidler, såsom ethylacetat-ethylether (1:1, v / v) 10,11. Forskellige plantemetabolitter udvindes i forskellige organiske opløsningsmidler, afhængigt af deres polaritet. For at sikre at plante organiske syrer eller baser er ekstraheret i organiske opløsningsmidler på dette stadium, kan pH af en alkohol-vand-ekstrakt hæves eller sænkes med en vandopløselig syre eller base til at konvertere dissocierede analytter i deres nondissociated former, som derefter opløseligt i neutralt organiske opløsningsmidler 9. Den organiske fase kan derefter evaporated under reduceret tryk eller under nitrogen og justeres til det ønskede volumen til TLC. PH af ekstrakten er usandsynligt, at være dødelige for bioassaydata mikroorganismer på grund af opdelingen af analytter i neutrale opløsningsmidler, lille afsluttende volumen og fordampning af ekstrakten på TLC-pladen forud for separation.
Både svampe og bakterier er ansat som test-mikroorganismer i bioautografi af planteekstrakter 2. Sporer af visse svampe, såsom Cladosporium cucumerinum spire på TLC-plader (bortset fra områder med inhiberende forbindelser), hvis sprøjtes på pladerne i en næringsopløsning og inkuberet i et fugtigt miljø i flere dage 3. Den mørke mycelium C. cucumerinum på inhiberende zoner giver en skarp kontrast til zoner gratis mycelievækst. Selvom bakterier er blevet anvendt til tyndtlagskromatografi (TLC) plader på samme måde 4,12, bakterier er også hældes over TLCplade overflader i agar overlejrer 13,14. Gær, såsom Candida albicans, kan anvendes i agar overlejringer samt 14. Alternativt kan TLC-plader placeres med forsiden nedad på agar podet med bakterier 10,15 eller gær 8, en metode, der kaldes kontakt bioautografi 2.
Vi beskriver en metode til kontakt bioautografi at screene for antimikrobielle phenolforbindelser fra rødkløver (Trifolium pratense cv. Kenland). Testen mikroorganisme Clostridium sticklandii en ruminal hyper ammoniak-producerende bakterie (HAB) og obligate anaerobe. Selv om separationer anvendte ikke løser alle komponenter i ekstraktet, de lette identifikationen af zoner antimikrobiel aktivitet, og dermed indsnævre puljen af mulige antimikrobielle forbindelser. Protokollen anvender standardprocedurer for TLC 1.. Protokollen beskriver også nogle af de teknikker, der kræves til dyrkning forpligtelsergate anaerobe til en sådan analyse, en brug af kontakt bioautografi 15 og en visualisering metode med et tetrazoliumsalt, der farver levende celler 2,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udarbejdelse af planteekstrakt
- Se Kagan og Flythe 10 for udvinding af phenolforbindelser fra Trifolium pratense cv. Kenland.
- At udtrække andre forbindelser i andre planter, så tjek den fytokemiske analyse litteratur for plante-eller metabolit-specifikke udvindingsmetoder (mange er beskrevet), eller kigge efter protokoller såsom dem Khurram et al. 7,8, som isolerer mange forbindelser med en bred udvalg af polariteter.
2. Udarbejdelse af tyndtlagsplader
- Rene TLC-plader ved at udvikle et eller flere polære, neutrale opløsningsmidler, for at bevæge adsorberede forureninger væk fra zonen af udvikling.
- I et stinkskab, forberede nok rengøring opløsningsmiddel (f.eks 15-100 ml ethylacetat-methanol 2:1, v / v) til at dække bunden af TLC kromatografikammeret, samt den nedre kant af en TLC-plade, når den indstillede inde i kammeret.
- Brug forretningsmæssigtcielt tilgængelig glas TLC udvikle kamre (Fås i forskellige størrelser, med låg) eller folieklap Pyrex bægerglas eller henkogningsglas.
- Brug en saks til at klippe aluminium-eller plastic-backed (fleksible) silicagelplader, der kommer i forskellige størrelser (20 cm x 20 cm og mindre), til at passe den tilgængelige udvikle kammer. (Advarsel: silica kan give lungeskade ved indånding Arbejde i et stinkskab og håndtere TLC-plader med handsker for at undgå at få hud olier på silica..)
- Sæt pladerne ind i kammeret, med toppe skæve mod kammerets vægge. Pladerne må ikke røre hinanden. Dæk kammeret og lad opløsningsmidlet bevæge sig op pladen ved kapillarvirkning.
- Når opløsningsmiddel har nået toppen af pladerne, fjerne pladerne fra kammeret og arrangere i en stående position inden stinkskabet indtil opløsningsmidlet er afdampet.
- Kontroller at se, om urenheder har migreret nær toppen af TLC-pladen ved at kigge efter en gul bånd under synliglys, eller et fluorescerende bånd under ultraviolet (UV) lys (se "urenhed front" eller IF i figur 2B). Hvis flertallet af pladen stadig har et gulligt skær, gentag renseprocessen.
- Efter at have fjernet TLC-plader fra kammeret, kasseres opløsningsmidlet. Tillad resterende opløsningsmiddel fordampe helt, før du bruger kammer til protokol 2.
- For at fjerne resterende fugt, der kan påvirke migration af forbindelser på silica 16 prop pladerne oprejst i en tørreovn ved 100 ° C (10-15 min for en 20 cm x 20 cm plade, og 5 min i 7 cm x 10 cm plader ).
- Hvis en 100 ° C tørreovn ikke er tilgængelig, varme plader til en længere periode ved lavere temperaturer (dvs. 40 min ved 60 ° C).
- Efter at pladerne er tørre, så lad dem køle af til stuetemperatur før ilægning.
3. Udarbejdelse af Udvikling Chambers for Extract Separation
4.. Lastning og Udvikling af TLC-plader
- Let markere oprindelse med blyant. Hvis TLC-pladen adsorbent er blød og let beskadiget, lave mærker på kanterne. Forbindelser bør være over overfladen af opløsningsmidlet udvikle når pladerne er indsat i TLC-kammeret.
- Opløses ekstrakter nok organisk opløsningsmiddel (i dette tilfælde, methanol) for at få en koncentreret opløsning i stedet for en uklarsuspension.
- Load prøver og standarder som smalle bånd med en mikroliter sprøjte eller kapillarkolonne mikropipetter, efterlader en 1 cm kant på siderne af pladen. Lad bands til at tørre (lufte plade eller lægger det i et stinkskab hjælper).
- Hvis en større koncentration af prøven er nødvendig på en plade, "overspot" af isætning af prøver igen på de tørrede bånd.
- Med en pincet eller tang, sæt plade (r) i den mættede TLC kammer. Pladerne må ikke røre vægen fordi det kan give opløsningsmiddel til pladerne ved kontaktpunkter, således at berigtige vej sammensatte migration. Dæk kammeret og lad pladerne udvikle sig.
5.. Fremstilling af plader til bioassay
- Fjern plade (r) fra TLC tanken før vaeskefronten når toppen af pladen, og markere højden af opløsningsmidlet front med en blyant. Lad pladen tørre i stinkskab.
- Udvikle resterende TLC-plader i samme TLC kammer, der er gebetalings syste merne anvendelig for en hel dag, hvis de holdes lukket. Remake opløsningsmiddelblanding til TLC kammer, hvis mængden af opløsningsmiddel i kammeret falder markant.
- Efter pladerne er tørre, visualisere bands under synlige eller UV-lys, og afgrænse bands med en blyant. En visning kammer med en bærbar UV-lampe er praktisk, især hvis lampen kan detektere forbindelser ved både 254 nm (kortbølge-UV) og 365 nm (langbølge UV).
Bemærk: På dette tidspunkt eller efter det næste trin, kan pladerne pakket ind i plastfolie, dækket med folie og opbevaret ved -20 ° C. Maksimal opbevaringstid afhænger af sammensatte stabilitet. Fordi silica er ikke neutral, kan nogle forbindelser forringe mens du er på TLC-pladen. - Fotografere eller tegne plader.
- Brug en gel photodocumentation system, hvis den ene er udstyret med overhead UV-og / eller synlige lys er til rådighed.
- Hvis der ikke kommerciel photodocumentation system er til rådighed, fotografi plader inde i en æske foret med mørkt papir eller en klud, with et kamera sæt på et stativ og en bærbar UV-lys fastspændt på en ring stå 17. Når du fotograferer plader, der ikke har nogen fluorescerende indikator, skal du bruge et blåt lys filter over kameralinsen for at forbedre band udseende 17.
- Til hjælp i karakterisere bands, beregne retentionsfaktor (R f)-værdier ved at måle afstande, sammensatte og solvent front, og dividere førstnævnte af sidstnævnte (figur 2A).
6.. Bakteriekultur og Assay
- Forberede og vaccinere medier under anaerobe forhold. Kulturen anvendes i dette tilfælde var Clostridium sticklandii stamme SR, som blev opnået fra kulturen samling af James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY.
- Se Flythe og Kagan 13 og listen materialer til en beskrivelse af HAB medier.
- Dyrk kulturen til eksponentielle eller stationær fase. Anvend sterilt anaerob techniques, når man arbejder med anaerobe mikroorganismer.
- Podes kulturen (1% v / v) i smeltet agar efter temperaturen af agar (0,75% w / v) er faldet til mindre end 60 ° C. Bland forsigtigt og straks bringe ind i en anaerob kammer (95% CO 2 -5% H 2 atmosfære for HAB medier) til at hælde.
- Hæld i 15 mm x 100 mm plastik petriskåle, og lad det størkne.
- Med saks, klippe TLC-pladen i zoner, der indeholder bånd (r) af interesse. Lay bands ansigt ned på agarplader, mærkning bands på pladen opbakning til at holde styr på original orientering på TLC-plade. Lay en ubrugt TLC strimmel på en agarplade som en kontrol.
- Inkubér agarplader, agar nedad, i den anaerobe kammer (24 timers, 39 ° C).
7.. Visualisering af bioanalyseret agarplader
- Med pincet fjerne bands fra agarplader, mens de er i den anaerobe kammer.
- Tilsæt 1% (w / v) tetrazolium rød, fremstilles i vand, dråbevis på overfladerne af agarpladerne. Lad farven udvikle sig i mindst 20 minutter, eller indtil kontrol pladen bliver helt rød, før du fjerner fra den anaerobe kammer. De anaerobe bakterier vil begynde at miste levedygtigheden umiddelbart efter fjernelse fra den anaerobe kammer, men farven er stabil i mere end 24 timer.
- Fotografere under synligt lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative silica TLC separationer af rødkløver (Trifolium pratense cv. Kenland) ekstrakter, der indeholder phenolforbindelser, er vist i figur 2.. Adskillelse af rødkløverekstrakt i ethylacetat-hexan (9:1, v / v), mere end 8,5 cm, resulterede i fem bånd, et ufuldstændigt løst fra oprindelsen (figur 2A). Figur 2B viser imidlertid, at omkring dobbelt så mange bands blev afsløret, da en anden prøve af rødkløver ekstrakt (fra samme sort, men dyrket i et separat plot på samme gård) blev adskilt over en større afstand (15 cm i stedet for 8,5 cm) og med to på hinanden følgende udviklinger i forskellige opløsningsmiddelsystemer. Kromatogrammet i figur 2B blev udviklet først i ethylacetat-hexan (9:1, vol / vol) og fik derefter lov til at tørre og adskilt i ethylacetat-methanol (78:22, v / v). Disse resultater viser, at både pladestørrelse og valg af opløsningsmiddel-system (eller en række opløsningsmidler systems) kan påvirke antallet af forbindelserne adskilles på et kromatogram. I dette særlige tilfælde, eluering og højtydende væskekromatografi (HPLC) af bånd fra andre TLC separationer af samme ekstrakter bekræftede, at forbindelserne forbliver på eller i nærheden af oprindelsen bestod primært af phenolforbindelser (phenolsyrer eller isoflavoner) konjugeret til polære dele såsom aminosyrederivater, sukker eller æblesyre. I modsætning hertil isoflavoner ikke konjugeret til polære dele migreret længere op TLC pladerne 10.
Resultaterne af et bioassay af TLC-pladen vist i figur 2A med Clostridium sticklandii en ruminal hyper ammoniak-producerende bakterie (HAB), er vist i figur 3.. Tilføjelse af en 1% (w / v) vandig opløsning af tetrazolium rød til agarplader efter en 24 timers inkubation resulterede i en klar rød farve, når levende celler blev farvet. Inkubation af bånd 1 (biochanin A) og en del af band 2 (formononetin) om bakterier-podede agar resulterede i et veldefineret område af inhibering (fig. 3A). Inkubation af resten af båndet 2, sammen med bånd 3 og 4, som ikke hæmmer bakterievækst (figur 3B). Disse resultater viste, at biochanin A var hæmmende for C. sticklandii vækst, men formononetin var ikke.
Figur 2. Silica tyndtlagskromatografisk (TLC) adskillelse af ekstrakt af Trifolium pratense cv. Kenland udviklet i (A) ethylacetat-hexaner (9:1, v / v) eller (B) at samme opløsningsmiddel efterfulgt af udvikling i ethylacetat-methanol (78:22, v / v). Afstanden migreret af opløsningsmidlet mellem oprindelse (OR) og solvens foran (SF) er indiceret nærparentes mellem disse to grænser. I figur 2B "urenhed front" (IF, placering af urenhederne flyttes op pladen ved forvask i polære opløsningsmidler) ses som et mørkt bånd nær toppen af pladen. Ekstrakter, tilberedt 180-250 mg frysetørret rødkløver blade og stilke, blev opløst i methanol, og 10% af ekstrakt (A) eller 32% (B) blev læsset på silicaplader. Standarder læsset blev formononetin (f, 7,1 nmol), biochanin A (ba, 7,4 nmol), genistein (g, 9,8 nmol), og clovamide (Cl, 2B kun 8,7 nmol). Bands blev kredsede mens ses under et håndholdt UV-lampe ved 254 nm (kortbølge-UV) og 365 nm (langbølge UV). Et digitalt kamera blev anvendt til at fotografere pladen under kortbølget UV. Tallene til højre for kløver ekstrakt bands i figur 2A refererer til de zoner, skåret ud til bioassays. Retention faktorer (R f, distance traveled med band / distance af SF) er i parentes efter bandets numre i figur 2A.
Fig. 3. Resultater af TLC-plade bioassayene (A) bånd 1 og ufuldstændigt løst øvre del af båndet 2 fra TLC-pladen i figur 2A, og (B) bånd 2-4 fra samme TLC-plade. Bands blev lagt nedad på HAB inokuleret med Clostridium sticklandii og inkuberet anaerobt i 24 timer ved 39 ° C. Ved afslutningen af denne inkubationsperiode blev båndene fjernet, og agarpladerne blev farvet med en vandig opløsning af 1% (w / v) tetrazolium rød og fotograferet under synligt lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en enkel fremgangsmåde til adskillelse af en ekstrakt i delmængder af forbindelser og analysere disse delmængder ved kontakt bioautografi. Metoden er meget lig brugt af Chomnawang et al. 15. at screene for plantemetabolitter hæmmende for gonoré-bakterier. Den type bioautografi ansat til skærmen for antimikrobielle plante forbindelser afhænger af mange faktorer, herunder test mikroorganisme, setup laboratorium og præferencer for den person (er) udfører bioassay. Kontakt bioautografi, den metode, der anvendes i denne undersøgelse, er blevet kritiseret for, afhængigt af evnen af en forbindelse til at diffundere ind inokulerede medier 12. Hæmningszonerne løbet forbindelser ved lave koncentrationer, eller med lidt evne til at diffundere ind medier, kan ikke være påviselig, hvis der opstår vækst i agaren under diffusatkammeret. Desuden kan en hæmningszone skabt af en bånd spredt sig ud over bandets oprindeligegrænser, hvilket muligvis maskerer Haemningszonerne skabt af tilstødende forbindelser 14. Men kontakt bioautografi er en nem metode til at bruge, og evnen til at stable petriskåle minimerer mængden af nødvendige plads. Desuden om TLC bands på agar, eliminerer risikoen for båndet opløsning og spredning, der kan forekomme, når en TLC-plade er belagt med podede agar eller sprøjtes med forsøgsforbindelsen mikroorganisme.
Indhentning af oplysninger fra nogen af de ovennævnte typer af bioautografi afhænger af de kromatografiske betingelser, test mikroorganisme koncentration og kultur / inkubationsforhold. Kromatografisk opløsning af antimikrobielle bands er ikke uundværlig, men følsomheden kan være større for et godt løst bånd 6. Bands kan adskilles ved fremkaldelse på længere plader eller i flere opløsningsmiddelsystemer i en dimension (figur 2B) eller i to dimensioner ved at dreje en TLC-plade 90 grader før udviklingi et andet opløsningsmiddel 16,19. Polære forbindelser kan være vanskelige at adskille på silica uden brug af opløsningsmiddelblandinger, der indeholder syrer eller baser. Disse kan være livsfarlige for test mikroorganisme 12, selv om der er indberettet 14,15 brugen af små mængder af syrer. Alternative opløsningsmidler kan indbefatte vand eller methanol som komponenter 20,21. Polære forbindelser kan også løses på forskellige typer af TLC-plader, såsom plader overtrukket med C18-adsorbent eller mikrokrystallinsk cellulose. Dog kan væksten 12 eller følsomhed over for visualisering agent 14 blive negativt påvirket på nogle af disse adsorbenter.
Mange forskellige kombinationer af test mikroorganisme og medier kan bruges til bioautografi. Men flere faktorer skal overvejes, når du vælger mikroorganisme og medier. Medierne bør testes for at fastslå, at der ikke er nogen komponenter, der reducerer tetrazolium salt og forårsage en ikke-biologiske farveændring. Agar skal også være lys nok i farve til at give kontrast mellem de farvede celler og ufarvede hæmningszoner. En mikroorganisme, der kun kan vokse på overfladen af agar kan fjernes sammen med TLC band eller vaskes under farvning. Derudover vil valget af mikroorganisme / medium kombination, der minimerer gasproduktion reducere bobler i agaren. Rumen HAB vokse i et carbonat-buffered, kulhydrat-frit medium med en blanding af aminosyrer eller peptider som dyrkningsmediet. Agarpladerne er lys guld og gennemsigtig. Da C. sticklandii dyrkes i mediet, de fleste af de produkter, der er opløselige (flygtige fedtsyrer, ammoniak). Meget lidt gassen produceres, hvilket resulterer i en glat agarplade uden bobler.
Dette bioassay har et par potentielle anvendelsesmuligheder. Størrelsen af hæmningszonen kan anvendes som et groft estimat afstørrelsen af den inhiberende forbindelse, idet radius af den hæmmende område er proportional med logaritmen til den mængde af forbindelsen forårsager hæmning 17,22. Måske den mest almindelige brug af TLC plade bioassays er at begrænse antallet af mulige antimikrobielle forbindelser i et planteekstrakt. Efter Haemningszonerne identificeret ved et bioassay, kan de tilsvarende regioner på et duplikat TLC-plade elueres med et opløsningsmiddel, såsom methanol eller ethylacetat, og analyseret ved HPLC med ultraviolet spektroskopi detektion at begynde karakteriserer bioaktive forbindelser 10,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Omtale af firmanavne eller kommercielle produkter i artiklen er udelukkende til formål at give oplysninger og er ikke ensbetydende med anbefaling eller godkendelse af USDA. Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker afdøde Dr. Norm Taylor, Afd Plant and Soil Science på University of Kentucky, for at tillade os at bruge prøver fra hans røde kløver grunde til denne undersøgelse. Dette projekt blev finansieret af United States Department of Agriculture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 cm x 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50 µl Syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µl. Alternative sources are equivalent. |
| Micropipettes | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 cm x 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4 W or 6 W bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| Sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 | |
References
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.
- Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
- Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
- Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
- Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
- Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
- Robinson, T. The Organic Constituents of Higher Plants. , Burgess Publishing Co. (1963).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
- Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
- Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
- Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.
- Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
- Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
- Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.
- Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
- Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
- Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
- Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
- Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
- Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).
