Abstract
Coxiella burnetii, el agente que causa la fiebre Q, es una bacteria intracelular obligado. Ensayos de diagnóstico basado en la PCR se han desarrollado para la detección de C. ADN burnetii en cultivos celulares y muestras clínicas. PCR requiere un equipo especializado y una amplia formación de usuario final, y por lo tanto, no es adecuado para el trabajo de rutina especialmente en un área de recursos limitados. Hemos desarrollado un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para detectar la presencia de C. burnetii en muestras de pacientes. Este método se realiza a una única temperatura de alrededor de 60 ° C en un baño de agua o un bloque de calentamiento. La sensibilidad de este ensayo LAMP es muy similar a la PCR con un límite de detección de aproximadamente 25 copias por reacción. Este informe describe la preparación de la reacción usando reactivos liofilizados y visualización de los resultados utilizando azul de hidroxinaftol (HNB) o una lámpara de UV con colorante intercalante fluorescente en la reacción. Los reactivos de LAMP fueron lyophilizeta y se almacena a temperatura ambiente (RT) durante un mes, sin pérdida de sensibilidad de detección. Este ensayo LAMP es particularmente robusto porque la preparación de la mezcla de reacción no implica pasos complejos. Este método es ideal para su uso en entornos con recursos limitados donde la fiebre Q es endémica.
Introduction
La pequeña bacteria Gram-negativa Coxiella burnetii es el agente causante de la fiebre Q, que es una zoonosis en todo el mundo. Debido a la distribución mundial de la fiebre Q y la alta infectividad de C. burnetii, personal militar y civil de Estados Unidos desplegadas en el extranjero están en riesgo de ser infectados en las áreas endémicas.
La fiebre Q se manifiesta en dos formas: infecciones agudas y crónicas. La fiebre Q aguda se presenta con síntomas similares a la gripe, hepatitis, o la neumonía, y suele ser una enfermedad autolimitada con una baja tasa de mortalidad. Q-fiebre crónica, mientras que menos frecuente, a menudo resulta en endocarditis, que tiene una tasa de mortalidad mucho más alta si se deja sin tratamiento 1,2. Por lo tanto, el diagnóstico precoz para guiar un tratamiento adecuado es fundamental para el cuidado del paciente. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se han desarrollado ensayos para la detección de C. ADN burnetii en cultivos celulares y muestras clínicas 3-5 </ Sup>. Tanto PCR y qPCR son costosos ya menudo no es fácilmente disponible en las zonas con recursos limitados para el trabajo de rutina.
Originalmente descrito por Notomi 6, amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) ofrece un método de amplificación de ADN alternativo. Lámpara utiliza ADN polimerasa Bst para la síntesis de ADN de desplazamiento de cadena junto con conjuntos de cebadores especialmente diseñados que reconocen al menos seis regiones independientes del gen diana. La ventaja más significativa de LAMP es que la amplificación se produce en condiciones isotérmicas. Por lo tanto, sólo se requiere un baño de agua, calentador o una incubadora. Este método ha sido utilizado para detectar varios patógenos rickettsias 7-9. La visualización de los productos de ADN amplificados por electroforesis en gel es el método más preciso que puede diferenciar verdaderos positivos de falsos positivos debido a la amplificación no específica. Sin embargo, los procedimientos involucrados en la electroforesis en gel no son prácticos para ar de recursos limitadosEAS. Varios métodos alternativos han sido desarrollados para detectar los productos de reacción. Estos alternativa, como turbidez derivado de la formación de pirofosfato de magnesio 10 o el uso de un colorante intercalante fluorescente para ser visualizado con luz UV 11,12 son más favorables que la ejecución de un gel. Los reactivos de LAMP fueron estables durante un mes cuando se almacenaron a 25 ° C y 37 ° C, que son las temperaturas ambiente en los países tropicales y subtropicales donde la fiebre Q es endémica 13.
Un ensayo de lámpara fue desarrollado en nuestro laboratorio para detectar la presencia de C. burnetii en muestras de plasma 14. Aquí se describe un protocolo sencillo para la preparación de la mezcla de reacción LAMP a partir de los reactivos liofilizados. Los reactivos liofilizados son estables durante un mes cuando se almacena a temperatura ambiente. Cuando se combina con un método de visualización fácil, esto es un método ideal para usar para la detección de C. burnetii en un entorno de recursos limitados.
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Protocol
1. Preparar diluciones de ADN plásmido como estándar para la reacción LAMP
- Use un espectrofotómetro para medir la densidad óptica (DO) a 260 nm para determinar el plásmido (que contiene IS1111a gen diana de C. burnetii RSA 493) la concentración de ADN. Un OD 260 de 1 equivale a 50 g / l de ADN.
- Convertir la cantidad de ADN plásmido en el número de copias. Dado que el tamaño del plásmido es 6330 pb, el peso molecular de este plásmido es 4,1 x 10 6 g (6.330 pb x 649 g / bp). La concentración de ADN del plásmido es 34,2 ng / l (como se determina a partir del paso 1.1). 1 l de esta muestra de ADN contiene 34,2 ng de ADN plásmido, lo que equivale a 5 x 10 9 copias (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 gx 6,02 x 10 23) de ADN.
- Añadir 10 l de ADN plásmido (5 x 10 9 copias / l) a 90 l de agua para una dilución de 10 veces para hacer una muestra de ADN de 5 x 10 8 copias / l.
- Repita el paso 1.3 para preparar muestras de ADN de 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, y 5 x 10 0 copias / l.
2. Prepare la plantilla de ADN de muestras para la reacción LAMP
- Extraer ADN de muestras de plasma humano usando un kit Mini comercial de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Use un total de 200 muestras l para la extracción y eluir el ADN extraído en un volumen de 20 l.
3. Preparar 2x tampón de reacción LAMP se
- Mezclar 200 l de 10x tampón de Pol, 320 l de 5 M trimetilglicina, 12 l de 1 M MgSO 4, 280 l de mezcla de dNTP (10 mM cada uno) y 188 l de agua para hacer 1 ml de tampón 2x LAMP. Mezcle en un vórtex durante 10 s.
4. Realizar la lámpara estándar de Reacción
- Mezclar 12,5 l de 2x LATampón MP (tal como se preparó en el paso 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), KCl 20 mM, 16 mM MgSO4, 20 mM (NH 4) 2 SO 4, 0,2% de Triton X-100, trimetilglicina 1,6 M, 1,4 mM mezcla dNTP), 1,2 l de mezcla de cebador, 1 l de ADN polimerasa Bst (8 U / l), y 5,3 l de agua para hacer la mezcla de reacción (20 l) en un tubo de PCR de 0,2 ml.
- Añadir 5 l de ADN (del paso 1 o 2) a la mezcla de reacción de 20 l y mezclar bien.
- Cerrar el tubo e incubar a 60 ° C durante 60 minutos en un baño de agua o bloque de calentamiento. Esta es la temperatura óptima de reacción previamente determinada.
- Añadir 5 l de 10x tampón de carga de gel para terminar la reacción.
- Cargar 5 l de productos de reacción en un gel de agarosa al 2% teñido con intercalantes colorante de ácidos nucleicos.
- gel a 100 V correr durante 35 minutos en tampón 1x TBE.
- Visualizar los resultados por la luz UV.
5. Realizar reacción LAMP con reconstituidoreactivos
- Mezclar 125 l de 10x tampón, Pol 200 l de 5 M trimetilglicina, 7,5 l de 1 M MgSO 4, 667,5 l de agua para hacer 1 ml de tampón de reconstitución. Mezcle en un vórtex durante 10 s.
- Retire los tubos que contienen los reactivos liofilizados de la bolsa de papel de aluminio sellado. No utilizar los tubos si la bolsa de papel de aluminio no está cerrado o si está dañado.
- Añadir 20 l de tampón de reconstitución en cada tubo para resuspender los reactivos liofilizados.
- Mezclar pipeteando arriba y abajo de tampón 5 veces. Echar un vistazo para asegurarse de que los reactivos liofilizados están completamente re-suspendido. El polvo blanco debe desaparecer en el tubo.
- Añadir 5 l de molde de ADN (de la etapa 1 o 2) a los reactivos reconstituidos y mezclar bien.
- Cerrar el tubo e incubar a 60 ° C durante 60 minutos en un baño de agua o bloque de calentamiento.
- Añadir 5 l de 10x tampón de carga de gel para terminar la reacción.
- De carga 5 l de reacciónproductos a un gel de agarosa al 2% teñido con intercalantes colorante de ácidos nucleicos.
- gel a 100 V correr durante 35 minutos en tampón 1x TBE.
- Visualizar los resultados por la luz UV.
6. Realizar LAMP reacción con tampón de reconstitución que contiene HNB fluorescente o colorante intercalante
- Mezclar 125 l de 10x de Pol Buffer, 200 l de 5 M trimetilglicina, 7,5 l de 1 M MgSO 4, 7,5 l de HNB 20 mM (o 12,5 l de 100x colorante fluorescente de intercalación) y 660 l (o 655 l) de agua a hacer 1 ml de tampón de reconstitución. Mezcle en un vórtex durante 10 s.
- Utilice el tampón reconstituido preparado en la sección 6 para repetir los pasos 5.2 - 5.6.
- Visualizar los resultados por el ojo desnudo (de reacción que contiene HNB) o una luz UV (de reacción que contiene el colorante intercalante fluorescente).
7. Realizar reacción LAMP en tiempo real con escáner Tubo
- Añadir 5 l de ADN para la reconstituted reactivos que contienen colorante intercalante fluorescente, cerca del tubo y la inserta en el escáner de tubo.
- Ajuste la temperatura de incubación a 60 ° C. Medir la fluorescencia a 520 nm durante 60 min.
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Representative Results
Los reactivos liofilizados de LAMP en el interior del tubo de 0,2 ml contiene ADN polimerasa Bst, cebadores y dNTPs. 20 l de tampón de reconstitución se utiliza para volver a suspender los reactivos liofilizados. La figura 1 muestra los resultados de la reacción de lámpara en geles de agarosa con reactivos recién preparados y reactivos liofilizados. El reactivo liofilizado no reduce su actividad. LAMP reacciones preparados por ambos reactivos puede detectar 25 copias de plantilla de ADN. La Figura 2 muestra la detección de los productos de reacción con HNB o colorante intercalante fluorescente presente en la reacción. La adición de HNB a la reacción produce un cambio de color visual de púrpura a azul con 25, 50 y 100 copias de molde de ADN presentes en las reacciones. La inclusión de colorante intercalante fluorescente en la reacción muestra una señal de fluorescencia fuerte con la luz UV cuando 25, 50 y 100 copias de moldes de ADN están presentes. Se utilizó un escáner de tuboen este estudio para la detección en tiempo real. Esta máquina puede realizar 8 reacciones simultáneamente. La Figura 3 muestra utilizando el escáner de tubo para controlar las señales de fluorescencia en tiempo real, con presencia colorante intercalante fluorescente. Las señales de fluorescencia están por encima de la línea de base después de 14, 18, 21, y 23 min con 10 6, 10 4, 10 3, y 100 copias de molde de ADN en las reacciones.
Figura 1. Resultados de LAMP en gel de agarosa con reactivos recién preparados (A) y los reactivos liofilizados (B). Las mezclas de reacción se incubaron a 60 ° C durante 60 minutos. (A) Carril 1, 100 pb escalera; Carril 2 - 3, 4 - 5, 6 - 7 y 8 - 9 son reacciones con 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2.5 x 10, y no hay copias de ADN plásmido. (B) Carril 10 - 11, 12 - 13, 14 - 15, y 16 - 17 son reacciones con 2,5 x 10 x 3, 2.5 10 2, 2.5 x 10, y 0 copias de ADN plásmido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Métodos para detectar productos de la lámpara. HNB (A) o colorante intercalante fluorescente (B) se utiliza para detectar productos de la lámpara. Las reacciones se llevaron a cabo a 60 ° C durante 60 min. Carril 1 a 5, reacciones con 0, 10, 25, 50 y 100 copias del plásmido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Detección en tiempo real de la lámpara de los productos. Las reacciones se llevaron a cabo a 60 ° C durante 60 minutos. Las reacciones con 10 6 copias de plásmido (negro), 10 4 (rojo), 10 3 (verde), 100 (amarillo), 10 (azul), 1 (naranja) y 0 (marrón y marrón claro). Tres detecciones se realizaron de forma independiente. Ellos fueron altamente reproducible. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Anteriormente, hemos desarrollado un ensayo de lámpara sensible y específico de orientación del elemento de inserción 14 IS1111a. El elemento IS1111 fue seleccionado porque es muy conservadas entre las diferentes cepas de C. burnetii y su alto número de copias (7-110) en la bacteria (Klee 2006). Nuestros resultados muestran que la lámpara puede detectar aproximadamente 25 copias del elemento IS1111, que puede correlacionarse con tan poco como una copia cromosómica del ADN Coxiella. En este estudio, el ADN polimerasa Bst, cebadores de la lámpara y dNTPs fueron liofilizados y envasados en una bolsa de papel de aluminio con cremallera. La sensibilidad de estos reactivos liofilizados se mantiene en 25 copias; similar a los reactivos recién preparados para al menos un mes cuando se almacena a temperatura ambiente. Es muy importante asegurarse de que la bolsa de papel de aluminio está sellado correctamente antes de abrirlo. No utilizar los tubos si la bolsa de papel de aluminio no está cerrado o si está dañado. Esto puede causar la rehidratación of los reactivos liofilizados que conduce a la pérdida de su reactividad. El otro paso crítico es la resuspensión de los reactivos liofilizados con tampón de reconstitución. La reacción LAMP no funcionará correctamente con reactivos que no están totalmente re-suspendidas. Debido a las altas concentraciones de sal del tampón de reacción y de alta viscosidad de la solución trimetilglicina, no pueden ser liofilizadas con éxito con ADN polimerasa Bst, los cebadores de LAMP, y dNTPs. Un paso especial se requiere para preparar el tampón de reconstitución con esos componentes. Potencialmente la reacción LAMP se puede probar a bajas concentraciones de sal de baja o nula trimetilglicina. Si hay una condición de reacción que tiene la misma sensibilidad de detección pero con baja sal y baja concentración trimetilglicina, el reactivo liofilizado sólo necesita ser reconstituido con agua. Esto simplificará aún más las etapas de reacción.
Recientemente, Wang et al. 15 en comparación doce enLos ensayos de LAMP -house con el kit comercializado isotérmica Master Mix y ha encontrado los ensayos in-house tienen resultados positivos falsos. En nuestro laboratorio, hemos desarrollado varios ensayos lámpara para la detección de bacterias diferentes y nunca hemos encontrado resultados falsos positivos en estos ensayos in-house. Por otra parte, en las etapas iniciales del desarrollo del método LAMP, los ensayos fueron probados con tanto internamente mezcla maestra preparada y comercializada mezcla maestra y no se observó ninguna diferencia en la sensibilidad y especificidad de los ensayos.
Nuestro estudio también presenta varios métodos que no sólo pueden detectar los productos de LAMP sin necesidad de abrir los tubos de reacción para disminuir la probabilidad de contaminación cruzada de laboratorio, pero también tienen un tiempo de proceso más corto para leer resultados se comparan con el método de electroforesis en gel. La ventaja de utilizar estos métodos de detección mejorará en gran medida nuestra capacidad para realizar rápidamente el ensayo y el diagnóstico de un individuo con C. burnetii
A diferencia de los métodos basados en la PCR que se necesita un termociclador, un bloque de calentamiento, baño maría o incubadora se mantiene una temperatura constante alrededor de 60 ° C es todo lo que se requiere para el ensayo de LAMP. Esto hace que el ensayo particularmente adecuado en entorno de recursos limitados. A diferencia del ensayo original de LAMP, Bst ADN polimerasa, cebadores de LAMP, y dNTPs necesitar ser almacenados a -20 ° C. Estos reactivos liofilizados pueden almacenarse a temperatura ambiente que hace que sea aún más útil para un entorno de recursos limitados donde la fiebre Q es endémica. El estudio de estabilidad a largo plazo de los reactivos liofilizados a 4 ° C, 25 ° C y 37 ° C se encuentra actualmente en curso. En el futuro, nos gustaría demostrar que este ensayo LAMP utilizando reactivos liofilizados puede detectar C. burnetii con sensibilidad similar a lade PCR en un lugar remoto.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Centro de Investigación Médica de la Marina, la unidad de trabajo de investigación 6000.RAD1.J.A0310. Las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no reflejan necesariamente la política oficial o la posición del Departamento de la Marina, el Departamento de Defensa, o el gobierno de Estados Unidos. Wei Mei-Ching es un empleado del gobierno de Estados Unidos. Este trabajo fue preparado como parte de sus funciones oficiales. Título 17 USC §105 establece que "La protección de copyright bajo este título no está disponible para toda la obra del Gobierno de los Estados Unidos. ' Título 17 USC § 101 define una obra gobierno de Estados Unidos como un trabajo preparado por miembro del servicio militar o empleado del gobierno de Estados Unidos como parte de las funciones oficiales de esa persona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10x Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10x Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000x, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000x, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
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