Abstract
fonksiyonel reseptörler hücre içine giriş kazanmak için İnfluenza A virüsü (IAV) hemaglutininler hücre yüzeyinde sialik asitleri tanır. Yabani kuşları IAV için doğal rezervuar, ama IAV kümes hayvanları, domuz, at ve insanlara türler bariyerini geçebilir. Kuş virüsler insan virüsleri tercihen bir α2-6 bağlantı (insan-tipi reseptörler) ile sialik asit tanımak ise bir α2-3 bağlantı (avian tip reseptörler) tarafından sondan galaktoz bağlı sialik asit tanır. avyan virüs insan tipi reseptörlere uyum olup olmadığını izlemek için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Sentetik sialosides farklı kütüphaneleri ile glikan mikroarray'ler giderek reseptör özgüllüğünü değerlendirmek için kullanılır. Bununla birlikte, bu teknik, birleşmelere ölçmek için kullanılır. avidite ölçümü tipik olarak geleneksel polipropilen 96 oyuklu plakalara adsorbe glıkanlara seri olarak seyreltilmiş hemaglutinin veya virüs bağlanmasının değerlendirilmesi ile elde edilir. a Bu deneyde, glikanlar2-3 ya α2-6 sialik asitler biyotine bağlı olan ve streptavidin plakaları, adsorbe ya da doğrudan plastik adsorbe poliakrilamid (PAA) kuple edilir edilmiştir. Biz önemli ölçüde doğrudan mikro kuyu cam slaytlar PAA-bağlantılı sialosides ve onların olmayan PAA-bağlantılı muadilleri yazdırarak bu testte küçültülmüş var. tek bir slayt üzerinde 48 dizileri ile bu set-up, 6 glıkan olmayan iki sialilatlı kontrolleri dahil olmak üzere 6 farklı glikanlar, sorguya, 8 dilüsyonlarda bağlayıcı proteinlerin aynı anda tahlilleri sağlar. Bu geleneksel plaka deneyinde 18x 96 oyuklu plakalara eşdeğerdir. glikan dizi formatında bileşikleri ve biyolojik tüketimini azaltır ve böylece büyük ölçüde verimliliği arttırır.
Introduction
Yabani kuşları IAV doğal rezervuarı vardır, ama IAV kümes hayvanları ve insanlar da dahil olmak üzere memelilerde, türün engelini geçmek edebilmektedir. İnsan virüsler α2-6 bağlantılı sialik asitleri (insan-tipi reseptörler) bağlamak oysa Kuş iAVS, α2-3 bağlantılı sialik asitleri (avian tip reseptörler) tanır. Etkin bir şekilde çoğaltılması ve avyan IAV insan tipi reseptör 1 bağlanma ihtiyacı insanlar arasında aktarabilmelidir için.
IAVS kendi hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) zarf glikoproteinler antijenliğini karakterize seroloji dayalı ayrılır. UA, viral yaşam çevrimi ve yarılır sialik asit 2 diğer ucunda reseptör imha edici enzim ise HA, sialik asitleri bağlanır. H1N1, H2N2 ve H3N2 dahil olmak üzere tüm insan bulaşmasını virüsleri, bir kuş kökeni 3 var. İnsan geçitler birkaç kuş yıllardır son iki aşkın H5N1, H7N7, H7N9 ve ile meydana gelmiş olan en iyi bilinen; however, diğer alt tipler daha düzensiz insanları enfekte olan (H6N1, H7N1, • H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Neyse ki, bu virüslerin hiçbiri tam olarak insan tipi α2-6 bağlı sialik asit reseptörleri 5-8 adapte olmuş gibi görünüyor. kuş ya da diğer zoonotik virüslerin Adaptasyon insan sağlığı üzerinde yıkıcı bir etkisi olabilir insan konaklarda çoğaltma ve iletim karşılamak için. Bu nedenle, bu virüsler ortaya çıkan grip virüslerinin dünya çapında gözetim yardımcı olacak insan tipi reseptörlere bağlanmasının gelişen nasıl ön bilgi.
Reseptör tercihi belirlenmesi ilk farklı türlerin eritrositler kullanılarak aydınlatılmıştır ve grip araştırmacılar 9-12 arasında bir tercih tahlil kalır oldu. avyan virüs α2-3 sialik asit ve sialik asit bağlantılı α2-6 insan virüsleri tanır gösterim orijinal enzimatik li her ihtiva edecek şekilde eritrositlerin hemaglutinasyonu kullanılarak bir deneyde dayalı13,14 nkages. okuma hemaglütinasyon, virologists için standart bir deney olsa da, altta yatan glıkan yapıları, sadece uç bağlantısı tanımlanmış değildir. Ayrıca, hücrelerin yeniden sialylate için kullanılan Sıyalıltransferazlar, sınırlı kullanılabilirlik, bu testte 15-18 kullanımını kısıtlamıştır. Daha sonra, reseptör bağlanma tercihleri belirleyen diğer yöntemler plaka bazlı tahlillerde 19,20 poli-akrilamid (PAA) ya da poli-glutamat (PGA) yapılarıyla bağlantılı sialilatlı glıkan yapıları kullanılarak eklenir. Çeşitli varyasyonlarının, sağlam, güvenilir ve çok hassas ELISA tipi deney 21-23 sonuçlanan, her biri mikrotitre plakaları için glikanlar veya virüs ya kaplanması mümkündür. Seçenek olarak ise, biotin bağlantılı glıkanlar PAA / PGA yerini alabilir ve streptavidin kaplı plakalar 2,24 konjuge edilebilir. bazı özel sera gerekli olabilir, ancak ELISA PAA bağlantılı standart ve çeşitli glıkanlar kolaylıkla are commercially ve olmayan piyasada mevcut (Fonksiyonel Glikomik için Konsorsiyumu (http://www.functionalglycomics.org)).
Glikan mikroarray teknolojileri çok farklı glukanlardır lekeli olarak, reseptör özgüllüğünü belirlemek için paha biçilmez bir araç olarak ortaya çıkmıştır, ve farklı yapıları geniş bir dizi bağlayıcı tek bir tahlil 25-29 içinde değerlendirilebilir. Bu yapılara IAV bağlanmasının IAV, tercihen 30-33 kabul glıkan yapılarının daha iyi anlaşılmasını sağlar. Glıkan mikroarray'ler bağlayıcı tahlili gerçekleştirmek için örnek hacminin küçük miktarlarda ihtiyaç ve sadece nokta (2 nl) başına glıkanın dakika miktarda kullanır. Ancak, bu diziler genelde glukanlardır reseptörlerinin özgüllüğünü değerlendirmek için sadece kullanılır. Birden fazla konsantrasyon aralıklarında birden virüsler veya hemagglutinin proteinlerin analizi nedeniyle gerekli slaytlar sayısına engelleyici olabilir. Ayrıca, bugüne kadar, hiçbir nispi avidite tahlil glikan ar kullanılarak geliştirilmiştirışını teknikleri.
kıyasla glıkan mikrodizi teknikleri ve ELISA bazlı deneylerde PAA-bağlantılı glıkanların duyarlılık elde düşük örnek gereksinimi birleştirmek için, benzer ya da daha iyi çözünürlük ile yüksek verimli analizi için izin verecek bir çok-çukurlu glıkan dizi geliştirmeye çalıştılar geleneksel ELISA bazlı bir deney için. Aynı zamanda, biz tüketilen biyolojik ve raportör kimyasalların miktarını en aza indirmek istedik. Nihai sonuç, özellikle IAV özgüllük izlemek için geliştirilmiş bir minyatür avidite miktar tayini testinde, ve diğer glıkan bağlayıcı proteinleri değerlendirmek için de geçerlidir. Teflon maske ile 48 mikro kuyulara ayrılmış bir cam slayt kullanarak 6 farklı glukanlardır kuyu başına 6 tekrarlı fark vardır. mikroarray platformu reseptörü aynı eğilimler çeşitli avantajlara sahip makro ELISA formatında görülen bağlayıcı tanıyor. Bu çok sayıda satır kaplama, karşı minimum numune kullanılarak (I) 6 tekrar bileşiğin baskı dahil IOyuk başına 100 ul kullanılarak na plakası; (II) çok farklı bileşikler kontrolleri de dahil olmak üzere tek bir kuyuda, aynı anda analiz; (III) bir kuluçkalama hacminde ve büyük bir azalma; (IV) floresan okuma kullanarak daha büyük bir dinamik aralık. Tek bir slayt 18x 96 oyuklu plakalara denk olduğu hesaplanabilir.
Aşağıdaki protokol imalatı ve analiz herhangi bir laboratuvar özelliğine sahip mikroarray'ler bu minyatür ELISA biçimi üretmek gerekir gördü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
1. Dizi İnşaat
- Glycan Hazırlama ve Plaka Kur
- baskı tampon stok hazırlayın. Ana dibazik sodyum fosfat, 150 mM stok çözeltisi, 500 ml yapmak. Ayrıca monobazik sodyum fosfat solüsyonu, 150 mM'lik bir stok çözeltiden 50 ml yapmak. Bir şişe içinde, 8.5 olan bir pH elde edilene kadar yavaş yavaş monobazik çözeltisi ile iki bazlı sodyum fosfat çözeltisi titre, karıştırma çubuğu ve pH metre manyetik kullanılmıştır. % 0.005 Tween-20 ekleyin.
- glıkan örnekleri hazırlayın. Paa konjüge glikanlar, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) ve 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Şekil 1A seyreltilir )) 100 ug seyreltilmiş edilecek / step1.1.1. Tek değerli glıkanlardan tampon baskı mi,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH2) 3, NH2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH2) 3 NH2) ve 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - adım 1.1.1 baskı tamponu içinde 100 | iM kadar (CH2) 3, NH2)). Son olarak, ızgara belirteçleri / iniş ışıkları olarak kullanmak için, amin işlevselleştirilmiş boyaları hazırlar. Boya işaretleyici noktalar 1 uM'de yazdırılır.
NOT: Atto488-NHS boya bizim baskı kullanılmaktadır. Ancak, sürgülü tarayıcı tarafından okunabilen herhangi bir amin işlevselleştirilmiş boya bu amaç için uygundur. - Transfer baskı robot için kullanılan 384-çukurlu mikrotiter plakalarına her glıkan örnek 10 ul. sızdırmaz tüplerde -20 ° C'de baskı tampon çözeltisi içinde Kullanılmayan glıkanlar. Tansfer baskı plakasına boya marker 10 ul.
- Baskı
NOT: Tüm steps endişe dokunmadan veya eldiven ile yapılmalıdır slaytlar hareket olduğunu.- düzeni doğru yapılandırmasına göre baskı kafasına arrayer işaretçilerine yerleştirin. Bu düzen için tüm örnekler ve diziler yazdırmak için bir iğne kullanın. Aynı örnek noktaları birbirlerinin yanında tam olarak basılı olmayan şekilde, her bir tarafında, bir özelliğe atlama (özelliği, belirli bir bileşiğin, tek bir nokta olarak tanımlanır), altı blok glikanlar Baskı.
NOT: Son kullanıcı yapılandırmasını karar vermelidir. - çanta, açık kutuları slaytları çıkarın ve her slayt ultra-yüksek saflıkta Azot gazı üfleme yüzeylerinde olabilecek toz parçacıkları veya plastik küçük parçalar çıkartın. arrayer sahnede, yukarı slaytlar istenilen sayıda, kaplamalı tarafı yerleştirin.
- Program arrayer, baskı pimleri ucunda aşırı sıvı kaldırmak için, poli-L-lizin kaplı slaytlar üzerine "ön noktalar" 3 kullanarak, kaynak plakasına ziyaret başına 27 noktalar parametreleri kullanmak
- MPU (Ana Güç Ünitesi) ve İklim Kontrol Birimi açın. bilgisayarda Açık Fayans Analizi yazılımı.
- Yazdırmak için seçin düzen. 1 tek pin - Seçenek → Pin Aracı dizisi 1 x 1 Yazıcı aracı yazdırmak için kullanılacak seçin. Hedef sekmesi → Aracı Dizi Tanımı → Baskı Desen seçin ve (nokta-to-spot mesafesi), satırlar ve örnekleri karşılamak için sütun sayısı basılacak sahayı ekleyin ve bu dizinin bir 8 için numune baskı kalıbı ( x 8 baskı desen 7 toplam numuneler için 340 mikron sahada) kullanılır.
- Hedef → Slayt Düzeni seçin ve 48-kuyu (4 x 12) slayt şablonuna her kopyalayan dizinin baskı izin bloğu-blok mesafeyi programlamak. Kaynak seçin ve (6 numune kuyuları ve 1 boya işaretleyici iyi karşılamak için kullanılacak olan bu baskı 7 kaynak alıcılar için) (1 pimi kullanırken her bir örnek için 1) kaynak alıcılar sayısını ekleyin.
NOT: YEŞİL açmalısınız kaynak diyalog numarası olduğunu göstermek içinKaynak ziyaretleri baskı kalıbı içinde basılacak örnekleri eşleşir. - Hedef → Adaptör Plakası seçin ve Düzen slayt hazırlama ve sayısını ayarlamak (5 slaytlar 1 ön tespit slayt bu baskı için bir kerede yazdırılır).
- Ön lekelenme slayt (MAVİ) ve "gerçek" slaytlar yerleri yakından ilgilenerek, tepsiyi etkinleştirmek ve tepsiye slaytlar istenilen sayıda eklemek için T1 butonuna tıklayarak tepsiyi serbest bırakın.
- vakum engellemek ve vakum etkinleştirmek için Tamam'a tıklayın kalan tüm vakum portlarında düz cam slaytlar yerleştirin. Tüm slaytlar yerinde tutulur emin olun ve ana konumuna tepsiyi geri dönmek için Tamam'a tıklayın.
- plaka tutucu içine baskı plakasını yükleyin ve raf yerine doğru ayarlanmış olduğundan emin olun. GO tıklayın ve baskı süreci devam etmesine izin.
- dizi başına 6 noktalar çoğaltır kalan 24 noktalar (4 diziler / kaynak ziyareti) yazdırın.
- 384 gözlü levhalar yükve yazıcının içine yazdırmaya başlamak. 55 ve% 65 arasında baskı boyunca, baskı sırasında, bağıl nemi muhafaza edin. Yazıcı 5 slaytlar yazdırdıktan sonra durur.
NOT: Bu tahlilde mikroarray belirli bir 8 x 8 desen baskılı edilirken, farklı mikroarray baskı robotları istenen düzeni sağlamak için ekipman özel programlama gerektirir. Bu onların ekipmanların özellikleri verilen en uygun desen belirlemek için son kullanıcıya kadar.
- düzeni doğru yapılandırmasına göre baskı kafasına arrayer işaretçilerine yerleştirin. Bu düzen için tüm örnekler ve diziler yazdırmak için bir iğne kullanın. Aynı örnek noktaları birbirlerinin yanında tam olarak basılı olmayan şekilde, her bir tarafında, bir özelliğe atlama (özelliği, belirli bir bileşiğin, tek bir nokta olarak tanımlanır), altı blok glikanlar Baskı.
- Nemlendirme / Sabitleme
NOT: slaytlar baskı bitirdikten sonra, geçici bir immobilizasyon adımı olarak da adlandırılan nemlendirme uğrarlar. sonrası baskı nemlendirme yeniden ıslatma noktalar ve tam engelleme sağlayarak örnek eki homojenize yardımcı olur.- Hemen 30 dakikalık bir süre için baskı sonra% 100 nem odasında slaytlar koyun. slaytlar, büyük bir cam çanak alt düz çok ıslak kağıt havlu koyarak koyarak odasına ConstructBazı tür bir test tüpü raf, baskı tarafı yukarı olarak raf, tür ve nem tuzak plastik wrap ile sızdırmazlık üzerinde.
- Number kuruma kutusunda bir alkol / solvent dirençli işaretleme kalemi ve mağaza ile slaytlar. Gecede birbirinden ayrılacak.
- Numaralandırma, Engelleme ve Depolama
- 50 mM borat tamponu 50 mM etanolamin - engelleme tampon hazırlayın. İlk olarak, bir manyetik karıştırma çubuğu içeren bir şişe içinde 50 mM nihai konsantrasyona kadar, GKD 2 O, borik asit çözülür. tüm katı çözünene kadar bir karıştırma plakası üzerinde kuvvetli bir şekilde solüsyonu ilave edin. Sürekli karıştırılırken, arzu edilen 50 mM konsantrasyon elde etmek üzere, bir 16.54 M stok çözeltisinden etanolamin uygun miktarda. 9.2'lik bir son pH ayarlamak için konsantre sodyum hidroksit ekleyin.
- 1 saat engelleme tampon çözeltisi içinde basılmış slaytlar daldırın.
- 1 saat sonra, tampon engelleme herhangi bir aşırı izlerini kaldırmak için GKD 2 O slaytlar durulayın.Uygun bir atık konteynerine engelleme tampon imha edin.
- Cam boyama sahiplerine slaytlar aktarın ve kuru dönerler. 5 dakika için 10 x g hızında, sallanma plaka tutucular ile donatılmış bir santrifüje yerleştirerek Kuru diziler.
- slaytlar kuru sonra, hemen kuluçkaya veya saklanabilir. Depolama koşulları kapalı bir plastik torba içinde -20 ° C 'dir.
2. Analiz Glycan Bağlayıcı Proteinler
- diziler uyacak hibridize edilecek olan nemlendirilmiş bir odada hazırlayın. Basit bir bölme nemlendirilmiş kağıt havlu ve slaytlar dinlenme olacak bunun üzerine bir raf ile alt katmanlı bir Pyrex çanak oluşur.
- Biyotinile lektinler kullanarak, SNA (Sambuka nigra aglutinin) ve tampon tarama 10 ug Streptavidin-555 boya / ml + 2 ug / ml ECA (Erythrina cristagalli aglutinin), (PBS +% 0.01 Tween-20). HA (bu örnekte A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 A / KY / 07 H1N1), kullanım içinDaha önce tarif edildiği gibi 34, 20 ug bir başlangıç konsantrasyonu mi, önceden kompleks /. Fare-α-Strep: Kısaca, bir HA hale blokaj tamponunda Keçi α-fare-Alexa647 karışımı (PBS +% 3 BSA +% 0.01 Tween-20), bir, 4: 2: 1 mol oranında.
NOT: Dizi lektinler ile incelendi glukanlardır hareketsiz ve algılanabilir (Şekil 1B) olduğunu tespit etmek için. - 384 plaka 20 ul glıkan bağlayıcı protein-antikor karışımı çözeltisini ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. tampon 10 ul örnek 10 ul karıştırılarak, bunların uygun bir tampon, 8 kez, 1: seri olarak lektin ve HA örnekleri 1 seyreltin.
- Pipet 8 mikro-çukurlu yüzeye örnek ul ve 90 dakika için sızdırmaz nemlendirme (% 100 bağıl nem) odasında inkübe edilir.
- Deiyonize H2O kenarları tutarak ve bir PBS karışımı ve% 0.05 Tween içinde dört kez onları daldırılarak seferinde slaytlar bir yıkama, PBS içinde daha sonra dört kez, ve son olarak da dört defa kullanmaengelleme adımında tarif edilen aynı kurutma protokolünü 10 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje diziler kuru dönerler.
3. Tarama ve Veri Analizleri
NOT: glikan mikroarrayler mikrodizin tarayıcının üreticisine bağlı olarak, farklı ayarlarla taranabilir. Lazer gücü ve çözünürlüğü değiştirilerek, enstrüman dinamik aralık (Şekil 1C) içinde mümkün olduğunca çok sayıda sinyallerle bir görüntü üretebilir.
- Bir floresan slayt tarayıcı kullanın ve hemen glikan bağlama proteinleri ile inkübasyondan sonra diziler tarayın. slayt doğru tarama cihazına yerleştirilir sağlamak için özen gösterin.
- Açık tarama yazılımı. programı açmak için Başlat düğmesini tıklatın. Tarayıcı navigasyon paneli menüsünde Tarayıcı → Bağlan ya da yeşil renkli: tarayıcıya bağlayın.
- Tarayıcının açık robotu kapı. belirli bir düzen içinde robotun yuvalara slaytlar yerleştirin. Kapat autoloader kapı. Clauto Araçlar navigasyon panelindeki Tran "okuma yükleyici" tarayıcı slaytlar algılar.
- Set tarama parametresi: deney (örneğin 635 lazer gücü yüksek, algılama kazanç% 50) uygun Tarayıcı → Tarama parametreleri. Tarama slaytlar: Tarayıcı → taraması. Tarama görüntüleri ve adı bireysel taramaları kaydetmek için bir klasör oluşturarak yolu seçin. Gerçek tarama için bu önceden yapın. her slayt için tekrarlayın. Taramayı başlatmak için Tamam'a tıklayın.
- slaytları enstrüman kurmak ve taramak için tarayıcı yazılımını kullanın. Set tarayıcı iteratif% 25,% 50 ve% 75 kazanç ayarlarını artan düşük lazer gücü (5 mW) tarama için.
NOT: Ayarlar test ve optimize edilmiş, ancak her tarama muhtemelen photobleaching nedeniyle boyaların floresan çıkışını düşürebilirsiniz akılda tutmak olabilir.- Açık veri toplama ve mapix yazılımı gibi analiz yazılımı. programı açmak için Başlat düğmesini tıklatın. Açık tarama görüntü: Açık im → Dosyayaş. Açık GAL dosyası: → açık ızgara analiz ve uygun GAL dosyayı seçin.
- bloklar moduna girin: Görüntü → bloklar moduna ızgara taşımak için. slaytta uygun konuma ızgara ayarlamak için ızgara işaretleri kullanabilirsiniz. basılı dizi maç için gerekli bireysel blok ayarlayın.
- noktalar moduna girin: Image noktalar modu → yerini ve blok içinde tek tek noktalar boyutunu ayarlamak için. Bir kez tüm bloklar ve lekeler ayarlanır ve yerinde, ölçü sinyal yoğunlukları ile → fotometrik hesaplamaları analiz edin. Çıktı dosyası olarak kaydedin.
- Slaytlar tarama bitirdikten sonra, görüntüler (- G Şekil 1D) yüklü görüntü işleme programı ile sinyallerin bağlanması için analiz edilir. görüntü analizi için, taranmış TIFF resmin üzerine bir GAL (Dizi Listesi) dosyası yükleyin.
Not: GAL dosya nokta düzeni desen ve her nokta konumu kimliklerini hem de içerir. diziler için GAL dosyaları crNumunelerin kimliklerini ve 384-kaynak plaka kendi konumunu içeren bir sekme ile sınırlandırılmış metin dosyasını kullanarak yazıcı yazılımı tarafından eated. - Düzgün GAL ızgara yerleştirmek için mikrodizinlerinde basılı ızgara işaretleyici / iniş ışıkları kullanın. Bireysel noktalar tek tek hareket gerekebilir, ama iyi basılmış dizi genellikle ızgara içinde bloklar kolaylıkla yerleştirilmesini sağlayacaktır. ızgara yerleştirilmesini takiben, yazılım tarafından nokta yoğunlukları toplamak ve bir sekme ile sınırlandırılmış metin dosyası (.txt) olarak kaydedilir.
- elektronik tablo programı kullanarak, tarayıcıdan çıktı dosyasını açın. klasör konumuna uygun makro dosyasını açın. Görünüm → Makro → MakroÇalıştır tıklayın.
NOT: önceden yazılmış, ham çıktı verileri kopyalamak gereksiz satır ve sütunları kaldırmak, numune verileri sıralamak, ortalama sinyaldir eksi arka plan değerlerini hesaplamak ve her biri için grafikleri içeren bir yayılma sayfalık çalışma sayfasına bileşke değerler arsa olacaktır altı samples dizinin üzerinde test.
- elektronik tablo programı kullanarak, tarayıcıdan çıktı dosyasını açın. klasör konumuna uygun makro dosyasını açın. Görünüm → Makro → MakroÇalıştır tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baskı, Tarama ve Veri analizleri
Uygun baskı sağlamak için, slayt, her dizi delineates teflon maske içinde benekli ızgara, doğru hizalama için hayati önem taşımaktadır. nedeniyle teflon kaplama doğası gereği, yazdırma sırasında, lekeler MPX slaytlar üzerinde çıplak gözle görülemez. Dikkat poli-L-lizin kaplı slaytlar üzerinde ön lekelerin ortaya sonra ödenir. Doğrudan baskıdan sonra, her slayt nedeniyle yerinde kurutulmuş tamponunun tuzları görülebilir her lekeli bileşiğin varlığı gözle kontrol edilmelidir. Diziler Teflon sınırları ve benekli özelliklerin doğru sayısı içinde lekelerin doğru hizalanması için denetlenmektedir.
Slaytlar fotoğraf beyazlatma önlemek için yüksek bir tarama güce daha düşük bir iteratif süreç içinde taranır ve HIG karşılaştırılması izin veriyoruzOnun avidite sırasıyla yüksek ve düşük çıkış sinyalleri avidite bağlanma proteinleri, düşürmek için. tarama ardından, çıkış görüntüleri her noktanın floresan yoğunluğu bir görüntüleme programı kullanılarak ölçülür. Her dizi dizi yüzeyi (- G Şekil 1D) yazdırılmış özelliklerin sayısını eşleşen bir ızgara dosyası yapıştırılmıştır. basılı floresan boyalar kullanarak, baskılı glukanlardır sınırları tanımlanmış ve baskılı numune kimliği ile entegre bir maske her nokta lassoes. Görüntüleme maskesi kement (boyut, sinyal yoğunluğu ızgara, vb koordinatları) görüntülü nokta tüm yönleriyle kaydetmek ve çıkış bir sekme ile sınırlandırılmış metin dosyasına bu bilgileri olacaktır. tablolama yazılımı (tablo) kullanarak, numuneler kimlik göre sıralanır ve ortalama sinyal yoğunluğu eksi arka plan aykırı olarak yüksek ve en düşük sinyal bırakarak, her bir numune için 6 noktalar üzerinden 4 ortalaması alınır. ortalama sinyaldir bir çizgi grafiğidireksi arka plan diziye uygulanan sekiz protein konsantrasyonları karşı çizilen ve her bir örnek için bir satır içerir. Son çıkış grafiği doğrusal olmayan bir regresyon hesaplama (Şekil 1 H) kullanılarak süzülür.
Glikan bağlama proteinleri
PAA-Dizi A virüsü hemaglutininler grip reseptör bağlanma özgüllüğünü belirlemek için kullanılır. Bizim dizinin bir diğer özelliği, benzer bir plaka deneyinde, mevcut değildir, aynı mikro-çukurlu olmayan sialilatlı kontrol dahil edilmesi. Bilinen özgüllük kullanılan baskılı bileşikler baskıdan sonra mevcut olduğunu değerlendirmek için, yaygın olarak kullanılan bitki lektinler. ECA N-asetil-glukozamin (Galβ1-4GlcNAc ya LacNAc) için β1-4 bağlı terminal galaktoz bağlanan ve terminal galaktoz sialik asit ile kaplı ise bağlamayacaktır. ECA sadece minyatür glikan arr olmayan sialilatlı glıkanlar algılarBugün (Şekil 2A). sialilatlı glıkan örnekleri herhangi bağlanma olmaması, bu tam terminal sialik asit ile kaplı olduğunu da göstermektedir. Α2-6 bağlantılı sialik asit için SNA, bir lektin kontrol (Şekil 2B) olarak kullanılmıştır. Beklendiği gibi, SNA, sadece bağlantılı sialik asitleri α2-6 bağlanan ancak PAA-bağlı olmayan PAA-bağlı di- LacNAc tekrarlar için afinite önemli farklar vardır. Bu fark, PAA-bağlantılı glıkanların hassasiyetini yansıtır ve düşük avidite ile bağlanabilir protein ayırt edilmesini sağlar. Α2-3 bağlantılı sialik asit, yalnızca α2-3 bağlantılı sialik asitleri tanıyan bilinen A / Vietnam / 1203-1204 virüsünden türetilmiş bir H5 hemagglutinin 6 kullanıldı. H5 HA bağlanma profili gerçekten PAA-bağlı yapılar (Şekil 2C) için daha yüksek bir avidite ile α2-3 bağlantılı sialik asitleri özgüllük göstermektedir. Son olarak, insan H1N1 suşundan H1 hemaglutinin kullanılmıştır, beklendiği gibi, yalnızcabağlantılı sialik asit içeren yapılar (Şekil 2D) α2-6 bağlı.
Şekil 1: Baskı, tarama ve görüntü analizleri (A) PAA-konjuge 6SLNLN cam slaytlar üzerinde yazılı olan bir temsilci glıkan yapısı olarak gösterilir.. Çok-çukurlu glıkan dizisinde bir glıkan bağlayıcı protein enkübe (B), bir dizi yüzey üzerinde damlacık oluşturur 8 ul hacmi ile gösterilmiştir. Konfokal flüoresan kayıcı tarayıcıya dizisi ve tarama uzerındekı glıkan bağlama proteinleri inkübasyonundan sonra (C), temsili bir görüntü elde edilir. (D) görüntü doğru hizalanması için ızgara işaretlerini kullanarak, bir ızgara ile yerleştirilmiştir ve tek noktalar analiz edilebilir. (E) yakın bir 8 diziler, komple bir set up hangi bir tek glikan bağlayıcı protein olarak1 dilüsyonları: Sekiz 1 kullanılarak analiz edilmiştir. Bir tek yuva (f) tek bir dizi temsil edilir; altı tekrarlı açıkça görülebilir olarak dizi sağ üst (3 lekeler) ve sol alt (2 noktalar) grid belirteçleri ile demarked olup, bu glıkan bağlayıcı protein dizisinde tek bir bileşik bağlar. (G) ızgara özel bireysel noktalar çevreleyen kementleriyle gösterilmiştir. (H) Görüntüleme yazılımı görüntü dosyası sinyal değerlerini hesaplar ve bir sekme ile sınırlandırılmış veri dosyası üretir. (I) veri veya bir temsilci çıkış grafiği oluşturmak için stastical yazılımda tablo olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: bitki lektinlerinde (ECA, SNA) ve IAV hema Çıktıfarklı özelliklerle sahip gglutinins göre (H5 A / Vietnam / 1203-1204, H1 A / Kentucky / 07) (A). ECA özellikle Terminal LacNAc ya Galb1-4GlcNAc bağlanır ve kontrol olarak kullanılan olmayan sialilatlı bileşiklerin varlığını algılar IAV hemaglutininler için. (B) SNA bir terminal α2-6 sialik asit taşıyan tek glikan tanır. (C) H5N1 rekombinant hemaglutinin (A / Vietnam / 1203-1204) suşu, sialik asitleri α2-3 bağlanan ve avyan tipi reseptör bağlanma profili sağlar. (D), bir insan H1N1 rekombinant hemaglutinin (A / Kentucky / 07) İnsan tip reseptörlerinin sadece bağlanır. Floresan sinyal yoğunluğu her nokta için ölçülmüş ve ortalama yoğunluk eksi arka plan elektronik tablo programı kullanılarak hesaplandı ortalama edildi. Her glikan için ortalama sinyal yoğunluğu 6 noktalar çoğaltır hesaplanır. 6 çoğaltır en yüksek ve en düşük sinyaller alınmış ve 4 kopya kalantes ortalama sinyali, standart sapma (SD) hesaplamak için kullanılır ve standart hata ölçümü (SEM). Grafikleri her bir örnek ve hata çubukları için ortalama ortalama sinyal eksi arka plan temsil SEM değeri vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IAV reseptör özgüllüğünü değerlendirmek kuş virüslerinin pandemik potansiyeli analizinde önemli bir adımdır. virüs, sialik asit tanıma bu hücreden bağlanarak ve salma gibi biyolojik özellikleri ile bağlantılıdır. kuş virüsleri bağlayıcı α2-6 ulaşmak ve türlerin bariyer pandemik hazırlık sağlayan geçmek için Bilgi amino asit mutasyonları gereklidir. Çeşitli deneyler reseptör özelliklerini belirlemek için kullanılır; Ancak, tüm tersi sadece ölçüm avidite ve özgünlük ve dahil olmak üzere dezavantajları var.
Burada daha karmaşık glikanların PAA-bağlanmış terminal parçaları kullanan yaygın olarak kullanılan ve kabul edilen ELISA dayalı yeni bir minyatür bir araç tarif eder. 4 iyi tanımlanmış lektinler, bitkinin 2 ve influenza A virüsünün 2 kökenli kullanarak, biz özgüllük ve bağıl avidite korumak olduğunu göstermektedir.
Biz kimyasallar ve biolog azaltılması miktarını hesaplamak zamanBir glıkan dizi çip üzerine ELISA minyatürize tarafından kullanılan iCal, biz çarpıcı büyük farklar ulaşır. İlk olarak, biyo; Biz 10x daha az tahlil hacmi kullanın ve 6 tekrarlı 6 test bileşiklerinin kullanılması; Bu 96 gözlü plakalar içinde 36x satır eşdeğer olduğu hesaplanabilir. Sonuç olarak biz 360X daha az biyo kullanmaktır. Kritik adımlar doğru baskı ve arındırılmamış glikan bağlayıcı ajanlar veya kötü tespit antikorları kullanarak yüksek kökenden riski bulunmaktadır.
Bu deneyde kullanılan bileşikler de kullanılabilir, ancak kolay bir kemo-enzimatik sentez ile yapılmış değildir. mikrodizi baskı teknolojisi kullanılarak, her bir nokta, bir mikrotitre plakası kaynağı başına 100 ul ile karşılaştırıldığında, sadece 2 nl. 6 tekrarlı 48 kuyu ve 6 bileşikleri içeren tek bir slayt yazdırma, biz yaklaşık 1.152 nl tüketir. Aynı konsantrasyonda bileşiğin 100 ul 1.842 kuyu toplam kaplama 96 oyuklu plakalar sonuçlar aynı kaplama prosedürü. Bu nedenle, baskı to biz 1,500x çarpıcı bir azalma elde plaka tahlile göre bileşik. Bu nedenle, toplam, biologicals 1500 kat 360 kat ve glikan tüketimi azalır. Robotik sıvı işleyici kullanarak, en adımları Bütün tahlil, bir yüksek verimli bir tarama olarak kullanılabilir sağlayan otomatik olabilir öngörülüyor.
Baskı mikroarrayler ve sonraki görüntü analizleri, özel makine ve araçlar gerektiren yapmak olsa da, bu araçlar nadir değildir ve birçok üniversite ve kurumlarında mevcuttur. Baskı doğrudan ve kimyasal değişiklikler gerektirmez. Bu nedenle, bileşikler ve basit bir baskı tekniği bu az miktarda, bu deney daha genel olarak geçerli olabilir, inanıyoruz. kuluçka hacmini azaltır olarak düşük maliyetli korurken, antikorlar ve değerli biyolojik maliyetleri, bu tekniğin IAV veya yüksek sadakat ile diğer glıkan bağlayıcı proteinlerin özgüllüğü değerlendirmek için sınırlı kaynaklarla laboratuarları için uygun hale getireceks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Scripps Mikroarray Core Tesisleri'nde, ve Centers for Disease Control (JCP) bir sözleşme ile kısmen desteklenmiştir. RPdV Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO) bir Rubicon ve VENI hibe bir alıcı. NIGMS hibe GM62116 (JCP) tarafından finanse Konsorsiyumu Fonksiyonel Glikomik için (http://www.functionalglycomics.org/) Bu çalışmada kullanılan çeşitli glikan sağladı. Bu Scripps Araştırma Enstitüsü'nden yayın 29.113 olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
- Bouvier, N. M., Palese, P.
- Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
- Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
- Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
- Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
- Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
- Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
- Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
- Rogers, G. N., D'Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
- Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
- Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
- Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
- Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
- Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
- Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
- Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
- Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
- Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
- Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
- Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
- Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
- Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
- Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
- Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
- de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
- Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
- de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).
