Summary

Перенос генов в Куриный органа по Слуховые<em> В Ово</em> Micro-электропорации

Published: April 17, 2016
doi:

Summary

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Abstract

Куриные эмбрионы являются идеальными модельные системы для изучения эмбрионального развития , как манипулирование функции генов может быть проведена с относительной легкостью в яйце. Внутреннее ухо слуховой сенсорный орган, имеет решающее значение для нашей способности слышать. В нем располагаются узкоспециализированный сенсорную эпителий, который состоит из клеток волос механико-преобразовательный (ГЦ) и окружающих глиальных как поддерживающие клетки (SCS). Несмотря на структурные различия в слуховых органах, молекулярные механизмы , регулирующие развитие слухового органа эволюционно консервативны у млекопитающих и Aves В ово электропорации в значительной степени ограничена на ранних стадиях E1 -. Е3. Из – за относительной позднего развития органа слуха при E5, манипуляциями слухового органа по ово в электропорации прошлом E3 затруднено ввиду опережающего развития куриного эмбриона на поздних стадиях. Метод, представленный здесь, является временным методом переноса гена для нацеливания генов, представляющих интерес вэтап Е4 – E4.5 в развивающемся куриной слуховом органа чувств с помощью в ово микро-электропорации. Этот метод применим для амплитудно и с потерей функции с экспрессирующих векторов на основе ДНК обычные плазмиды и могут быть объединены с в ово анализе пролиферации клеток путем добавления Эду (5-этинил-2'-дезоксиуридин) ко всему эмбриона на время электропорации. Использование зеленого или красного флуоресцентного белка (GFP или RFP) плазмид экспрессии позволяет экспериментатору быстро определить, успешно ли целевой электропорации слуховую часть проявляющего внутреннего уха. В этом методе бумаги, представительные примеры GFP электропорации образцов показаны; Эмбрионы собирали 18 – 96 ч после электропорации и адресности GFP к про-сенсорной области слухового органа была подтверждена РНК гибридизация. Метод бумаги также обеспечивает оптимизированную протокол для использования аналогам тимидина ОБР для анализа клеток Пролифжалюзей; пример на основе Edu анализа клеточной пролиферации, который сочетает в себе иммуно-маркировку и нажмите EDU химии обеспечивается.

Introduction

Несмотря на различия в морфологии и клеточных кучность между млекопитающих и птиц слуховом органа чувств, молекулярные факторы и пути , ответственные за развитие сенсорных HC , как полагают, эволюционно консервативны 1-3. Базилярной сосочка, в котором находится слуховой HCs и окружающих их ГКС, развивается как outpocketing внутреннего уха отоциста. Уже на раннем этапе пула HC и SC прародителей указана в ушные плакоды / ушные чашки нейронная-сенсорной области компетентного (НРД). Данные Судьба картированию свидетельствуют о том , что нейронные и сенсорные клоны связаны между собой и возникают из НРД , расположенной в передне-вентральной области ушные чашки или отоциста у мышей и цыплят 4,5. Во-первых, нейробласты вычленяются из НРД привести к нейронам слуховому-вестибулярный ганглий, который в конечном итоге расщепляется на слуховом и вестибулярном ганглиях. Эти нейроны иннервируют сенсорные HCs внутреннего уха и ядер в стволе мозга. Клетки-йпо-прежнему в НРД, как полагают, приводят к различным сенсорных участков, в том числе слухового органа чувств, состоящий из механико-преобразовательный сенсорных ГЦ и связанных с ними SCS.

В обоих кур и мышиным, орган слуха сенсорно прародитель выход из клеточного цикла и дифференцировки HC происходят в противоположных градиентов. У кур, слуховое прародитель выход из клеточного цикла начинается около ~ E5 и прогрессирует от основания к вершине, и от центра к периферии 6. Через день НС дифференциация начинается в вершине и прогрессирует к основанию 7. Изучение развития внутреннего уха у кур предоставляет множество технических преимуществ , как функциональные механизмы могут быть исследованы с относительной легкостью в яйце , в отличие от манипулирования эмбрионов в утробе матери и в других модельных системах, что требует сложных операций. Описанный здесь метод использует в ово микро-электропорации целевых генов , представляющих интерес в презумптивной basilaг площадь сосочек передне-вентрально в слуховым пузырьком конкретно в Е4.

Электропорация в яйце является метод , который хорошо известна и широко используется 8-14. Принцип метода электропорации основан на том факте , что нуклеотиды (например, плазмидная ДНК, синтетическую ДНК или РНК олигонуклеотиды) заряжены отрицательно. ДНК вводят в интересующую ткань. Когда электрический ток помещают поперек ткани, ток открывает переходные поры в клеточных стенках и обеспечивает поглощение ДНК, поскольку потоки отрицательно заряженная ДНК в направлении положительного электрода (анода). Для усиления из-функции экспериментов, представляющих интерес генов обычно субклонировали в экспрессирующие плазмиды, которые содержат соответствующие кассеты экспрессии для зеленого флуоресцентного белка (GFP) или красного флуоресцентного белка (RFP). Для потери из-функции экспериментов плазмиды на основе доминантных негативных конструкций репрессор или RNAi или морфолино конструкции сommonly использовали 15,16. Для подавления микроРНК (миРНК) Функция микроРНК губки конструкции, которые , как правило , плазмиду , на основе, могут быть использованы 17. Описанный здесь метод позволяет исследовать молекулярные механизмы , которые контролируют пролиферацию и дифференцировку в слуховом органе, как в ово методе микро-электропорации можно легко комбинировать с в ово анализе пролиферации клеток путем добавления Edu всему эмбриона.

Электропорации и добавление Эду выполняется на Е4 в слуховым пузырьком, который за один день до начала выхода из клеточного цикла в слуховом органе. Анализ органа слуха обычно проводят 18 – 96 ч после электропорации при E5 (Наступление сенсорных клеток-предшественников выхода из клеточного цикла), E6 (начало ХК дифференциации), и E7 (во время дифференцировки HC); а позже до ~ E9 (конец HC дифференциации). Этот метод электропорации переноса гена преходяще продолжительностью около ~ 4 дней, becauсебе гены интерес не интегрируются в геном, но этот метод применим для использования с подходящим плазмидных векторов экспрессии , основанных на ДНК, которые действительно имеют возможность интеграции в геном, такие как Tol2-опосредованного переноса гена 11. С помощью этого метода надежные GFP или RFP выражения длится ~ 4 дня в улитке, после чего указывают сигналы увядают, но обеспечивают достаточное окно времени, чтобы изучить запутанную развитие слухового органа. Это , в ово способе переноса генов является новым и позволяет конкретно целевой предположительный органа слуха при E4, который является оптимальным для исследований , которые сосредоточены на развитии HC в слуховом органе. Это является хорошим дополнением к альтернативным методам, которые электропорации на гораздо более молодых стадиях развития или 11,12 по сравнению с использованием в пробирке базилярной сосочков эксплантов культур 18.

Protocol

Яйца и невылупившиеся эмбрионы заботу и лечение с этической точки зрения и гуманно. Все протоколы для невыведенное использования эмбрионов были одобрены уходу и использованию животных комитета на Джона Хопкинса школы медицины, Балтимор, штат Мэриленд. 1. Яйца и подготов?…

Representative Results

В этом методе бумаги плазмидной ДНК, состоящей из зеленого флуоресцентного белка (GFP) кассеты экспрессии были направлены в разработку цыпленка базилярной сосочка (BP) с оптимизированными параметрами 12 В и 4 импульсов с длительностью 100 мс импульсов и интервалов 200 мс, чт?…

Discussion

Описанный здесь метод в ово микро-электропорации оптимизирован для переноса генов в развивающемся слуховом органе. Он совместим с экспрессирующими векторами на основе ДНК плазмиды обычно используются для манипулирования функции гена / экспрессии. Время проведения электропорац?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим доктора Дорис К. Ву для экспрессии плазмид и зондов измерений в точке, Университета имени Джона Хопкинса Центр Сенсорное объекта биологии визуализации и Центр слуха и равновесия. Эта работа была поддержана NIDCD Грант T32 DC000023 на LE

Materials

Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12×24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

References

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. , e306 (2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).

Play Video

Cite This Article
Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

View Video