基因转移到鸡听觉器官通过<em>在卵</em>微电
Summary
The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.
Abstract
鸡胚胎是研究胚胎发育为基因功能的操作可以与卵内相对容易地进行理想模型系统。内耳听觉感觉器官是我们听到的能力至关重要。这房子是由机械力转导毛细胞（HCS）一个高度专业化的感觉上皮和周围神经胶质样支持细胞（SCS）。尽管在听觉器官的结构差异，调节听觉器官的发展的分子机制的哺乳动物和禽类动物之间是进化保守的。在卵内电穿孔在很大程度上限制为E1的早期阶段- E3。由于在E5听觉器官的相对发展较晚， 在OVO电过去E3听觉器官的操作由于鸡胚在稍后阶段先进的开发都很难。这里介绍的方法是一种用于在靶向的目的基因瞬时基因转移方法阶段E4 -通过卵内的微电E4.5在显影鸡听觉感官。这种方法适用于GAIN-和失功能与常规质粒基于DNA的表达载体，可与卵细胞增殖试验通过在加入的EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）的全胚胎被组合电的时间。使用绿色或红色荧光蛋白（GFP或RFP）表达质粒可以让实验者快速确定是否电针对成功发展内耳听觉部分。在该方法中纸张，GFP电穿孔样品的代表性实例示出;胚胎收获18 -电后96小时和听觉器官的亲感觉区GFP的目标是通过RNA原位杂交证实。该方法本文还提供了使用胸苷的优化协议模拟的EdU分析细胞prolif关合作;提供结合免疫标记，然后点击的EdU化学基于的EdU细胞增殖试验的一个例子。
Introduction
尽管在形态和哺乳动物和鸟类听觉感觉器官之间的差异的蜂窝图案，分子因素和负责感官HC发展途径被认为是进化上保守的1-3。基底乳头，里面听觉碳氢化合物及其周围旺，发展为内耳听囊的outpocketing。早期HC和SC祖细胞的池耳placode /耳杯的神经感官能力的域（NSD）内指定。命运映射数据提供证据表明，神经元和感官谱系被链接，并从设在耳杯的前-腹侧区域或在小鼠和鸡4,5-听囊的NSD出现。首先，成神经细胞从NSD脱层到产生听觉前庭神经节，最终分裂成听觉和前庭神经节的神经元。这些神经元支配内耳和原子核在脑干的感觉碳氢化合物。细胞届在保持在NSD被认为会引起各种感觉补丁，包括听觉感觉器官，由机械性传感感官碳氢化合物及其相关的SC的。
在鸡和鼠两个，听觉器官感觉祖细胞周期退出和HC分化发生在相反的梯度。在小鸡，听觉祖细胞周期出口开始围绕〜E5和从基部到顶点的进行，并且从中心到周边6。一天后，HC分化开始在顶点和前进到基座7。在鸡研究内耳的发展提供了许多技术优点的功能机制可以在相对 于在子宫内的其他模型系统，这需要复杂的手术操纵胚卵内相对容易进行调查。这里所描述的方法使用在卵内的微电靶向感兴趣的基因中的推定basila- [R乳头区前，在腹侧在专门的E4耳泡。
电穿孔卵内是很好地建立和常用8-14的技术。电穿孔技术的原理是基于这样的事实，核苷酸（ 例如，质粒DNA，合成DNA或RNA寡核苷酸）被带负电荷。将DNA注射到感兴趣的组织。当电流被置于穿过组织，目前在细胞壁打开瞬态孔，并允许该DNA的摄取，因为带负电荷的DNA的朝正电极（阳极）流动。对于增益的功能的实验中，感兴趣的基因通常亚克隆到包含绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP）适当的表达盒的表达质粒。对于失功能实验基于质粒的显性负阻抑构建体，或RNAi，或吗啉代构建体是Commonly使用15,16。以抑制微小RNA（miRNA）的函数的miRNA海绵结构，这是典型的质粒基于，可以使用17。在这里描述的方法允许调查控制细胞增殖和分化的听觉器官的分子机制，因为卵内的微电穿孔法可以很容易地与卵内细胞增殖试验加入的EdU整个胚胎相结合。
在电穿孔和另外埃杜是在E4在耳泡，这是细胞周期退出的听觉器官发病的前一天进行。听觉器官通常进行18分析 – （HC分化过程中）96小时电穿孔后在E5（感官祖细胞周期出口的发病），E6（HC分化的开始），和E7;后来高达〜E9（HC分化的终点）。这种基因转移的电穿孔法是短暂持续大约〜4天，becau本身的兴趣的基因不整合到基因组中，但该方法适用于具有适当的质粒DNA为基础的表达载体，其是有整合到基因组中，如TOL2介导的基因转移11的能力使用。用这种方法强大的GFP或RFP表达持续〜4个天耳蜗，在此之后的信号褪色，但提供了充足的时间来研究听觉器官的复杂发展。这在卵基因转移方法新颖，允许专门针对在E4假定的听觉器官，这是最佳的，专注于HC发展的听觉器官调查。这是一个很好的补充替代方法，这在电穿孔更加年轻的发育阶段的11,12或相比，使用体外基底乳头外植体培养18。
Protocol
Representative Results
Discussion
的卵内的微电穿孔的这里描述的方法是用于基因转移到显影听觉器官优化。它与典型地用于操纵基因功能/表达质粒DNA为基础的表达载体相容。电在E4的时机是最佳的，专注于HC发展的听觉器官调查。最关键的步骤是微型喷射的DNA导入耳泡腔不打算与针太深并损坏耳泡（参照图1A-D）中 ，靶向DNA插入通过耳囊的前腹域相应地放置电极（参照图1C），并在12 V…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢多丽丝·K.吴博士为表达质粒和原位探测，约翰·霍普金斯大学中心的感官生物成像设备和中心的听力和平衡。这项工作是由NIDCD格兰特T32 DC000023到LE支持
Materials
| Sterile 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | |
| Banana to Micrograbber Cable Kit | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 |
| Right Handed & Left Handed Micromanipulators | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L |
| Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts | World Precision Instruments Inc. | M10 |
| Metal Steel Base Plate 12×24 inch | World Precision Instruments Inc. | 5479 |
| Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors | World Precision Instruments Inc. | 14120 |
| Micropippette Puller for pulling needles | Sutter Instrument Co. | P-97 |
| 2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament | Sutter Instrument Co. | |
| Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 |
| Hamilton Glass Syringe 100 μl | Hamilton | 80601 Model 710LT |
| Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe | Fisher Scientific | O122-1 |
| Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand |
| 3 cc Disposable Syringes | Becton Dickinson and Company (BD) | 309657 |
| Disposable 21 Gauge Needles | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 |
| One pair of 2 mm Platinum Electrodes | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 |
| Electrode Holder | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 |
| One pair of Dumont fine forceps number 5 | Fine Science Tools (FST) | |
| Matte finish invisible tape for sealing eggs | Office Depot | 520-928 |
| Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 23-400-101 |
| Sterile filter tips |
References
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