نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها<em> في البيضة</em> الصغرى Electroporation لل
Summary
The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.
Abstract
أجنة الدجاج هي أنظمة النموذج المثالي لدراسة التطور الجنيني كما يمكن إجراء التلاعب وظيفة الجين مع السهولة النسبية في البيضة. الأذن الداخلية السمعي الجهاز الحسي هو أمر حاسم لقدرتنا على الاستماع. ويضم ظهارة متخصصة للغاية الحسية التي تتكون من خلايا الشعر transducing والميكانيكية (المراكز الصحية) والمحيطة الدبقية مثل الخلايا الداعمة (المنبوذة). وعلى الرغم من الاختلافات الهيكلية في أجهزة السمع، الآليات الجزيئية التي تنظم تطوير الجهاز السمعي يتم حفظها تطويريا بين الثدييات وأفيس electroporation في البيضة محدودة إلى حد كبير في المراحل المبكرة في E1 – E3. نظرا للتطور في وقت متأخر نسبيا من الجهاز السمعي في E5، التلاعب من الجهاز السمعي بواسطة electroporation في البيضة الماضي E3 صعبة نتيجة لتطور متقدمة من الجنين الدجاج في مراحل لاحقة. الطريقة المعروضة هنا هي طريقة نقل الجينات عابرة لاستهداف الجينات في المصالح فيمرحلة E4 – E4.5 في تطوير السمعية الدجاج الجهاز الحسي عبر في البيضة-Electroporation للالصغرى. هذا الأسلوب ينطبق على gain- والخسارة من وظائف مع البلازميد التقليدية ناقلات التعبير المعتمدة على الحمض النووي ويمكن الجمع بين في البيضة مقايسة انتشار الخلايا بإضافة ايدو (5 إيثينيل-2'-deoxyuridine) إلى الجنين كله في وقت Electroporation لل. استخدام أخضر أو أحمر بروتين فلوري (GFP أو طلب تقديم العروض) البلازميدات التعبير يسمح للمجرب لتحديد بسرعة ما إذا كان Electroporation للاستهدفت بنجاح الجزء السمعي في الأذن الداخلية النامية. في هذه الورقة الطريقة، يتم توضيح الأمثلة النموذجية على GFP electroporated العينات. وكان حصاد الأجنة 18-96 ساعة بعد Electroporation للواستهداف GFP إلى منطقة موالية للالحسية للجهاز السمعي ما أكده الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين. ويقدم ورقة الأسلوب أيضا على بروتوكول الأمثل لاستخدام الثيميدين التناظرية ايدو لتحليل prolif خليةeration. وتقدم مثالا للمقايسة انتشار الخلايا EDU على أساس أن يجمع المناعية وضع العلامات وانقر EDU الكيمياء.
Introduction
وعلى الرغم من الاختلافات في الشكل والزخرفة الخلوية بين الثدييات والطيور الجهاز الحسي السمعي، ويعتقد أن العوامل الجزيئية ومسارات المسؤولة عن التنمية HC الحسية يجب الحفاظ تطويريا 1-3. حليمة القاعدي، الذي يضم المراكز الصحية السمعية والمنبوذة المحيطة بها، ويطور باعتبارها تجيب خارجي من الكيسة السمعية في الاذن الداخلية. في وقت مبكر على مجموعة من الأسلاف HC وSC المحدد ضمن اللوحاء أذني / أذني نطاق المختصة كوب العصبية الحسية (إس دي). توفر البيانات مصير رسم خرائط دليل على أن الأنساب العصبية والحسية ترتبط وتنشأ من NSD تقع في منطقة انتيرو بطني من الكأس أذني أو الكيسة السمعية في الفئران والدجاج 4،5. أولا، neuroblasts delaminate من NSD تثير الخلايا العصبية من العقدة-السمعية الدهليزي، الذي انشق في نهاية المطاف إلى العقد السمعي والدهليزي. هذه الخلايا العصبية يعصب المراكز الصحية الحسية في الأذن ونوى الداخلية في الدماغ. الخلايا عشرفي البقاء في مديرية الأمن القومي ويعتقد أن تثير مختلف بقع الحسية، بما في ذلك الجهاز الحسي السمعي، ويتألف من المراكز الصحية الحسية transducing والميكانيكية والمنبوذة المرتبطة بها.
في كل فرخ والفئران، الجهاز السمعي الحسي السلف خروج دورة الخلية وHC التمايز يحدث في معارضة التدرجات. في الفرخ، السلف السمعي-دورة الخلية خروج يبدأ حول ~ E5 وتقدم من القاعدة إلى القمة، ومن المركز إلى المحيط 6. في وقت لاحق يوم واحد، يبدأ HC التمايز في قمة وتقدم إلى قاعدة 7. دراسة تطوير الأذن الداخلية في الدجاج يوفر العديد من المزايا التقنية كما يمكن التحقيق الآليات الوظيفية مع السهولة النسبية في البيضة بدلا من التلاعب الأجنة في الرحم في نظم نموذج أخرى، الأمر الذي يتطلب عملية جراحية معقدة. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم في البيضة Electroporation للالجزئي لاستهداف الجينات في المصالح في باسيلا الظنيص منطقة حليمة الأمامي-البطني في الحويصلة الأذنية على وجه التحديد في E4.
Electroporation للفي البيضة هو الاسلوب الذي راسخة وتستخدم عادة 8-14. ويستند مبدأ أسلوب Electroporation للفي حقيقة أن النيوكليوتيدات (على سبيل المثال، البلازميد، الحمض النووي الاصطناعي، أو الحمض النووي الريبي [أليغنوكليوتيد) واتهم سلبا. يتم حقن الحمض النووي في الأنسجة من الاهتمام. عندما يتم وضع التيار الكهربائي في جميع أنحاء الأنسجة، والتيار يفتح مسام عابرة في جدران الخلايا ويسمح لامتصاص الحمض النووي، كما يتدفق الحمض النووي سالبة الشحنة نحو القطب الموجب (الأنود). للتجارب مكاسب من وظيفة، وsubcloned جينات الفائدة عادة إلى التعبير البلازميدات التي تحتوي على أشرطة التعبير المناسبة للبروتين أخضر فلوري (GFP) أو بروتين أحمر فلوري (RFP). لفقدان وظيفة من التجارب القائمة على البلازميد المهيمنة يبني السلبية كاظمة، أو رني، أو يبني morpholino هم جتستخدم ommonly 15،16. لمنع الرنا الميكروي (ميرنا) وظيفة miRNAs يبني الاسفنج، التي عادة ما تكون البلازميد مقرها، ويمكن استخدامها 17. يسمح الطريقة هنا وصف للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تتحكم في انتشار والتمايز في الجهاز السمعي، كما في البيضة طريقة Electroporation للالصغيرة يمكن الجمع بسهولة مع البيضة في فحص تكاثر الخلايا بإضافة EDU إلى الجنين كله.
يتم تنفيذ Electroporation للوإضافة ايدو في E4 في الحويصلة الأذنية، الذي هو قبل يوم واحد من بداية خروج دورة الخلية في الجهاز السمعي. تحليل الجهاز السمعي هو عادة يؤديها 18-96 ساعة بعد Electroporation للفي E5 (بداية من السلف الحسي خروج دورة الخلية)، E6 (بداية التمايز HC)، وE7 (خلال التمايز HC)؛ وفي وقت لاحق إلى ~ E9 (نهاية التمايز HC). هذه الطريقة Electroporation للنقل الجين هو عابر دائم تقريبا ~ 4 أيام، becau حدحد ذاته جينات الفائدة لا الاندماج في الجينوم، ولكن الأسلوب هو المعمول به للاستخدام مع البلازميد المناسب ناقلات التعبير المعتمدة على الحمض النووي، التي لا تملك القدرة على الاندماج في الجينوم، مثل نقل الجينات بوساطة Tol2-11. مع هذا الأسلوب GFP قوي أو التعبير طلب تقديم العروض يستمر ~ 4 أيام في القوقعة، وبعد ذلك نشير إشارات تتلاشى، بعد توفير نافذة متسع من الوقت لدراسة تطوير معقدة من الجهاز السمعي. هذا في البيضة طريقة نقل الجينات هي رواية ويسمح خصيصا لاستهداف الجهاز السمعي المفترض في E4، الذي هو الأمثل للتحقيقات التي تركز على التنمية HC في الجهاز السمعي. بل هو إضافة جيدة إلى الطرق البديلة، التي electroporate في مراحل نمو أصغر من ذلك بكثير 11،12 أو بالمقارنة مع استخدام في المختبر الحليمات القاعدي الثقافات يزدرع 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تحسين طريقة هنا وصف للفي البيضة Electroporation للالصغيرة للنقل الجينات في الجهاز السمعي النامية. وهو متوافق مع البلازميد ناقلات التعبير المعتمدة على الحمض النووي عادة ما تستخدم للتلاعب وظيفة الجين / التعبير. توقيت Electroporation للفي E4 هو الأمثل للتحقيقات التي تركز على ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور دوريس ك وو لالبلازميدات التعبير وفي تحقيقات الموقع، ومركز جامعة جونز هوبكنز للمنشأة الأحياء التصوير الحسي ومركز السمع والتوازن. وأيد هذا العمل من قبل NIDCD غرانت T32 DC000023 جنيه
Materials
| Sterile 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | |
| Banana to Micrograbber Cable Kit | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 |
| Right Handed & Left Handed Micromanipulators | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L |
| Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts | World Precision Instruments Inc. | M10 |
| Metal Steel Base Plate 12×24 inch | World Precision Instruments Inc. | 5479 |
| Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors | World Precision Instruments Inc. | 14120 |
| Micropippette Puller for pulling needles | Sutter Instrument Co. | P-97 |
| 2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament | Sutter Instrument Co. | |
| Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 |
| Hamilton Glass Syringe 100 μl | Hamilton | 80601 Model 710LT |
| Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe | Fisher Scientific | O122-1 |
| Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand |
| 3 cc Disposable Syringes | Becton Dickinson and Company (BD) | 309657 |
| Disposable 21 Gauge Needles | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 |
| One pair of 2 mm Platinum Electrodes | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 |
| Electrode Holder | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 |
| One pair of Dumont fine forceps number 5 | Fine Science Tools (FST) | |
| Matte finish invisible tape for sealing eggs | Office Depot | 520-928 |
| Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 23-400-101 |
| Sterile filter tips |
References
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
- Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
- Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
- Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
- Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
- Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
- Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
- Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
- Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
- Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
- Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
- Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
- Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
- Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
- Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
- Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
- Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. , e306 (2007).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
- Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
- Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
