A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em> In Ovo</em> Micro-eletroporação

Summary

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Abstract

Embriões de galinha são sistemas modelo ideal para estudar o desenvolvimento embrionário como manipulações da função do gene pode ser realizada com relativa facilidade in ovo. O ouvido interno órgão sensorial auditivo é fundamental para a nossa capacidade de ouvir. Ele abriga um epitélio altamente especializada sensorial que consiste em células ciliadas de transdução mecano (HCs) e envolvente glial-como células de suporte (SCS). Apesar das diferenças estruturais nos órgãos auditivos, os mecanismos moleculares que regulam o desenvolvimento do órgão auditivo são evolutivamente conservada entre mamíferos e aves Em electroporação in ovo é largamente limitado a fases precoces em E1 -. E3. Devido ao desenvolvimento tardio relativa do órgão auditivo na E5, manipulações do órgão auditivo por em eletroporação in ovo passado E3 são difíceis devido ao desenvolvimento avançado do embrião de galinha em fases posteriores. O método aqui apresentado é um método de transferência de genes transitória para alvejar genes de interesse noestágio E4 – E4.5 no frango auditivo órgão sensorial desenvolvimento via in ovo micro-eletroporação. Este método é aplicável para gain- e perda de funções com vectores de expressão baseados em DNA de plasmídeo convencional e pode ser combinada com a proliferação celular num ensaio in ovo adicionando EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) para todo o embrião no tempo de electroporação. O uso da proteína fluorescente verde ou vermelho (GFP ou RFP) plasmídeos de expressão permite que o experimentador para determinar rapidamente se a eletroporação alvo com sucesso a porção auditiva do ouvido interno em desenvolvimento. Neste trabalho método, exemplos representativos dos espécimes GFP electroporadas são ilustrados; embriões foram recolhidas 18-96 horas após a electroporação e a segmentação de GFP à região pró-sensitivo do órgão auditivo foi confirmada por RNA de hibridação in situ. O papel método também proporciona um protocolo optimizado para a utilização da timidina EdU analógico para analisar célula prolifração; um exemplo de um ensaio de proliferação celular baseado EdU que combina imuno-marcação e clique EdU química é fornecida.

Introduction

Apesar das diferenças na morfologia e padronização celular entre os mamíferos e órgão sensorial auditiva aviária, os fatores moleculares e vias responsáveis ​​pelo desenvolvimento HC sensorial são pensados ​​para ser evolutivamente conservada ^1-3. A papila basilar, que abriga os HCs auditivas e suas SCs circundantes, se desenvolve como um outpocketing do otocyst ouvido interno. Logo no início de uma piscina de progenitores HC e SC é especificado dentro do plac�io ótica ótica domínio / copo neural-sensorial competente (NSD). Dados destino de mapeamento de fornecer evidências de que linhagens neuronais e sensoriais são ligados e surgem da NSD localizada na região antero-ventral do copo ótica ou otocyst em ratos e galinhas ^4,5. Em primeiro lugar, neuroblasts delaminate da NSD para dar origem aos neurônios do gânglio auditivo-vestibular, o que acabou dividida em gânglios auditivo e vestibular. Esses neurônios inervam os HCs sensoriais do ouvido interno e núcleos no tronco cerebral. As células Them permanecer no NSD são pensados ​​para dar origem a várias manchas sensoriais, incluindo o órgão auditivo sensorial, que consiste em os HCs sensoriais de transdução mecano e seus SCs associados.

Em ambos os pintos e murino, órgão auditivo progenitor sensorial saída do ciclo celular e diferenciação HC ocorrer em gradientes opostos. Em pintinho, progenitor auditiva saída do ciclo celular começa em torno de ~ E5 e progride a partir da base para o ápice, e do centro para a periferia ^6. Um dia mais tarde, começa HC diferenciação no vértice e progride para a base ^7. Estudando o desenvolvimento do ouvido interno em frango proporciona muitas vantagens técnicas como mecanismos funcionais podem ser investigadas com relativa facilidade in ovo em oposição a manipulação de embriões no útero, em outros sistemas de modelos, que requer cirurgias complexas. O método descrito aqui utiliza in ovo micro-electroporação de genes alvo de interesse no Basila presuntivoárea de papila r ântero-ventral na vesícula ótica especificamente a E4.

A electroporação in ovo é uma técnica que está bem estabelecida e utilizada ^8-14. O princípio da técnica de electroporação, é baseado no facto de nucleótidos (por exemplo, ADN de plasmídeo, DNA sintético, RNA ou oligonucleótidos) são carregadas negativamente. O ADN é injectada no tecido de interesse. Quando uma corrente eléctrica é colocada ao longo do tecido, a actual abre poros transientes nas paredes das células e permite a captação do ADN, como flui do ADN carregado negativamente em direcção ao eléctrodo positivo (ânodo). Para as experiências de ganho-de-função, os genes de interesse são subclonados em vulgarmente plasmídeos de expressão que contêm cassetes de expressão adequados para a proteína verde fluorescente (GFP) ou a proteína fluorescente vermelha (RFP). Para as experiências de construções de perda de função com base em plasmídeos dominantes negativos repressores, ou RNAi, ou construções morfolino são commonly usado ^15,16. Para inibir microARN (miARN) função miARNs construções de esponja, que são tipicamente plasmídeo com base, pode ser usado ^17. O método aqui descrito permite investigar os mecanismos moleculares que controlam a proliferação e diferenciação no órgão auditivo, em que o método de micro-electroporação in ovo pode ser facilmente combinado com no ensaio de proliferação celular in ovo adicionando EdU a todo o embrião.

A electroporação e a adição de EdU é realizada em E4 na vesícula ótica, que é um dia antes do início da saída do ciclo celular no órgão auditivo. Análise do órgão auditivo é tipicamente realizada 18-96 horas após a electroporação em E5 (aparecimento de células progenitoras saída sensorial do ciclo celular), E6 (início da diferenciação HC), e E7 (durante a diferenciação HC); e mais tarde até ~ E9 (fim da diferenciação HC). Este método de electroporação de transferência de genes é transitória que dura aproximadamente 4 dias ~, because os genes de interesse não se integram no genoma, mas o método é aplicável para utilização com vectores de expressão à base de ADN de plasmídeo apropriado, que têm a capacidade de integrar no genoma, tal como a transferência de genes mediada ^Tol2-11. Com este método GFP robustos ou expressão RFP dura ~ 4 dias na cóclea, após o que apontam os sinais desaparecem, mas fornecem uma janela de tempo suficiente para estudar o desenvolvimento intrincado do órgão auditivo. Este, por método de transferência de genes in ovo é novo e permite que visar especificamente o órgão auditivo presuntivo em E4, que é ideal para as investigações que incidem sobre o desenvolvimento HC no órgão auditivo. É um bom complemento para métodos alternativos, que electroporate em muito mais jovens estágios de desenvolvimento ^11,12 ou em comparação com o uso de in vitro papilas basilar de explantes culturas ^18.

Protocol

Os ovos e embriões não eclodidos são cuidadas e tratadas de forma ética e humana. Todos os protocolos de utilização de embriões unhatched foram aprovados pelo Animal Care e do Comitê Use na Johns Hopkins School of Medicine, em Baltimore, Maryland. 1. Os ovos e Preparação de construções de expressão Ovos: Incubar 3-4 dúzia de ovos de galinha fertilizados (Gallus gallus) deitado em seus lados a 37 ° C. Após 24 horas de incu…

Representative Results

Neste ADN método papel plasmídeo consistindo de proteína fluorescente verde (GFP) cassetes de expressão foi alvo para o desenvolvimento de frango papila basilar (PA), com parâmetros optimizados de 12 V e 4 impulsos com 100 duração do impulso mseg e intervalos de 200 mseg, obtendo-se uma ~ taxa de sobrevivência embrionária 50% e eficiência de plasmídeo de DNA alvo para a BP. Imagiologia de fluorescência da expressão da GFP nativa no desenvolvimento de embriões mostraram este…

Discussion

O método aqui descrito de in ovo micro-electroporação é optimizado para a transferência de genes para o órgão auditivo em desenvolvimento. É compatível com vectores de expressão baseados em DNA de plasmídeo tipicamente usadas para manipular a função do gene / expressão. O momento da eletroporação na E4 é o ideal para as investigações que incidem sobre o desenvolvimento HC no órgão auditivo. Os passos mais críticos são micro-injecção do ADN para o lúmen vesícula ótica sem ir muito pro…

Materials

Sterile 1x PBS pH 7.4	gibco	10010-023
Fast Green FCF Powder	Sigma	F7252-5G
EdU Powder	Invitrogen	E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit	Invitrogen	C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)	Qiagen	12643
ECM 830 ElectroSquarePorator	BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit	BTX Harvard Apparatus	45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators	World Precision Instruments Inc.	M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts	World Precision Instruments Inc.	M10
Metal Steel Base Plate 12×24 inch	World Precision Instruments Inc.	5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors	World Precision Instruments Inc.	14120
Micropippette Puller for pulling needles	Sutter Instrument Co.	P-97
2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament	Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm	FHC	27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl	Hamilton	80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe	Fisher Scientific	O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic	Becton Dickinson and Company (BD)	427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes	Becton Dickinson and Company (BD)	309657
Disposable 21 Gauge Needles	Becton Dickinson and Company (BD)	305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY611P3-2
Electrode Holder	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5	Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs	Office Depot	520-928
Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	23-400-101
Sterile filter tips