Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em> In Ovo</em> Micro-elettroporazione

Summary

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Abstract

Embrioni di pollo sono sistemi modello ideale per lo studio dello sviluppo embrionale, come manipolazioni di funzione del gene possono essere svolte con relativa facilità in ovo. L'orecchio interno uditiva organo sensoriale è fondamentale per la nostra capacità di sentire. Ospita un epitelio altamente specializzato sensoriale che è costituito da cellule ciliate meccano-trasduzione (HC) e dintorni gliali-come le cellule di supporto (SCS). Nonostante le differenze strutturali negli organi uditivi, meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo dell'organo uditivo sono evolutivamente conservati tra mammiferi e aves In elettroporazione Ovo è in gran parte limitata alle prime fasi a E1 -. E3. A causa della relativa ritardato sviluppo dell'organo uditivo a E5, manipolazioni dell'organo uditivo di elettroporazione in ovo passato E3 sono difficili a causa dello sviluppo advanced dell'embrione di pollo in fasi successive. Il metodo qui presentato è un metodo di trasferimento genico transitoria per il targeting dei geni di interesse afase E4 – E4.5 in via di sviluppo pollo uditivo organo sensoriale via in ovo micro-elettroporazione. Questo metodo è applicabile per GAIN- e perdita di funzioni con plasmide convenzionale vettori di espressione basati sul DNA e può essere combinato con in saggio di proliferazione delle cellule ovo aggiungendo EdU (5-etinil-2'-deossiuridina) per l'intero embrione allo tempo di elettroporazione. L'uso di proteina fluorescente verde o rosso (GFP o RFP) plasmidi di espressione consente allo sperimentatore di determinare rapidamente se l'elettroporazione di mira con successo la porzione uditiva del sviluppo dell'orecchio interno. In questo lavoro il metodo, esempi rappresentativi di esemplari GFP elettroporate sono illustrate; embrioni sono stati raccolti 18-96 ore dopo l'elettroporazione e il targeting della GFP per l'area pro-sensoriale dell'organo uditivo è stata confermata da RNA ibridazione in situ. Il documento metodo fornisce anche un protocollo ottimizzato per l'uso della timidina analogico EdU analizzare prolif cellulerazione; un esempio di un saggio di proliferazione cellulare basato EdU che combina immuno-etichettatura e cliccare EdU chimica è fornito.

Introduction

Nonostante le differenze nella morfologia e patterning cellulare tra mammiferi e aviaria organo sensoriale uditivo, i fattori molecolari e dei percorsi responsabili dello sviluppo HC sensoriali sono pensati per essere evolutivamente conservato ^1-3. La papilla basilare, che ospita le HC uditive e le loro SC circostanti, si sviluppa come un outpocketing del otocyst dell'orecchio interno. Nella fase iniziale di un pool di progenitori HC e SC è specificato all'interno del / otic dominio competente tazza neurale-sensoriale otic placode (NSD). Fate dati di mappatura dimostrano che lignaggi neuronali e sensoriali sono collegati e nascono dalla NSD situato nella regione antero-ventrale della coppa otic o otocyst nei topi e pollo ^4,5. In primo luogo, neuroblasti delaminano dal NSD per dare origine ai neuroni del ganglio uditivo-vestibolare, che alla fine diviso in gangli uditivo e vestibolare. Questi neuroni innervano i HC sensoriali dell'orecchio interno e nuclei del tronco cerebrale. Le cellule Tha rimanere nel NSD si pensa di dare origine a varie patch sensoriali, tra cui l'organo sensoriale uditivo, costituito dai HC sensoriali meccano-trasduzione e le loro SC associati.

In entrambi il pulcino e murino, organo uditivo progenitrice sensoriale uscita del ciclo cellulare e la differenziazione HC si verificano in opposte gradienti. In pulcino, uditivo progenitrice uscita del ciclo cellulare inizia intorno ~ E5 e progredisce dalla base all'apice, e dal centro alla periferia ^6. Il giorno dopo, la differenziazione HC inizia nel vertice e progredisce alla base ^7. Studiando lo sviluppo dell'orecchio interno nei polli offre molti vantaggi tecnici meccanismi funzionali possono essere studiate con relativa facilità in ovo al contrario di manipolare embrioni in utero in altri sistemi modello, che richiede interventi complessi. Il metodo descritto qui utilizza in ovo micro-elettroporazione per indirizzare i geni di interesse nella Basila presuntivaR zona della papilla antero-ventrale nella vescicola otica specificamente a E4.

Elettroporazione in ovo è una tecnica che è ben consolidata e comunemente usato ^8-14. Il principio della tecnica elettroporazione si basa sul fatto che i nucleotidi (ad esempio, DNA plasmidico, DNA sintetico, o RNA oligonucleotidi) sono caricati negativamente. Il DNA viene iniettato nel tessuto di interesse. Quando una corrente elettrica viene inserito attraverso il tessuto, la corrente si apre pori transitori nelle pareti cellulari e permette l'assorbimento del DNA, come il DNA caricato negativamente fluisce verso l'elettrodo positivo (anodo). Per gli esperimenti di guadagno di funzione, i geni di interesse sono comunemente subclonati in plasmidi di espressione che contengono adeguate cassette di espressione per Green Fluorescent Protein (GFP) o proteina fluorescente rossa (RFP). Per la perdita di funzione esperimenti plasmide-based dominanti costrutti negativi repressori, o RNAi, o costrutti morpholino sono commonly usato ^15,16. Per inibire microRNA (miRNA) funzione miRNA costrutti spugna, che sono tipicamente plasmide base, può essere utilizzato ^17. Il metodo qui descritto permette di indagare i meccanismi molecolari che controllano la proliferazione e la differenziazione nell'organo uditivo, come nel metodo di micro-elettroporazione ovo possono essere facilmente combinati con in test di proliferazione cellulare ovo aggiungendo EdU a tutta dell'embrione.

L'elettroporazione e l'aggiunta di EdU viene eseguita a E4 nella vescicola otica, che è un giorno prima della comparsa di uscita del ciclo cellulare nell'organo uditivo. L'analisi dell'organo uditivo è in genere eseguita 18-96 ore dopo l'elettroporazione in E5 (insorgenza di uscita del ciclo cellulare progenitrici sensoriale), E6 (insorgenza di differenziazione HC), e E7 (durante la differenziazione HC); e poi fino a ~ E9 (fine differenziazione HC). Questo metodo elettroporazione del trasferimento genico è transitorio della durata di circa ~ 4 giorni, because i geni di interesse non si integrano nel genoma, ma il metodo è applicabile per l'uso con adeguato plasmide vettori di espressione basati sul DNA, che hanno la capacità di integrarsi nel genoma, come ad esempio il trasferimento genico mediato Tol2 ^11. Con questo metodo GFP robusto o espressione RFP dura ~ 4 giorni nella coclea, dopo che indicano i segnali di dissolvenza, ma forniscono una finestra di tempo sufficiente per studiare lo sviluppo intricato dell'organo uditivo. Questo metodo di trasferimento genico in ovo è nuovo e consente di indirizzare specificamente l'organo uditivo presuntiva in E4, che è ottimale per le indagini che si concentrano sullo sviluppo HC nell'organo uditivo. Si tratta di una buona aggiunta ai metodi alternativi, che l'elettroporazione in molto più giovani stadi di sviluppo o ^11,12 rispetto all'uso di in vitro basilare papille culture espianto ^18.

Protocol

Le uova non schiuse e gli embrioni sono curati e trattati eticamente e umanamente. Tutti i protocolli per l'uso degli embrioni unhatched sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Usa presso la Johns Hopkins School of Medicine, Baltimora, Maryland. 1. Le uova e la preparazione di costrutti di espressione Uova: Incubare 3-4 dozzina di uova di gallina fecondate (Gallus gallus) disteso su un fianco a 37 ° C. Dopo 24 o…

Representative Results

In questo DNA metodo della carta plasmide composto di proteina fluorescente verde (GFP) cassette di espressione è stata mirata al pollo in via di sviluppo papilla basilare (BP) con parametri ottimizzati da 12 V e 4 impulsi con 100 durata degli impulsi msec e gli intervalli di 200 msec, ottenendo un ~ tasso di sopravvivenza del 50% degli embrioni e l'efficienza del plasmide-DNA mira alla BP. Imaging fluorescente di espressione GFP nativa in embrioni di mostrato questo metodo di elett…

Discussion

Il metodo qui descritto di in ovo micro-elettroporazione è ottimizzato per il trasferimento genico in via di sviluppo dell'organo uditivo. E 'compatibile con il plasmide vettori di espressione basati sul DNA tipicamente utilizzati per manipolare la funzione del gene / espressione. I tempi di elettroporazione in E4 è ottimale per le indagini che si concentrano sullo sviluppo HC nell'organo uditivo. Le fasi più critiche sono micro-iniezione del DNA nel lume vescicola otic senza andare troppo in pro…

Materials

Sterile 1x PBS pH 7.4	gibco	10010-023
Fast Green FCF Powder	Sigma	F7252-5G
EdU Powder	Invitrogen	E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit	Invitrogen	C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)	Qiagen	12643
ECM 830 ElectroSquarePorator	BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit	BTX Harvard Apparatus	45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators	World Precision Instruments Inc.	M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts	World Precision Instruments Inc.	M10
Metal Steel Base Plate 12×24 inch	World Precision Instruments Inc.	5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors	World Precision Instruments Inc.	14120
Micropippette Puller for pulling needles	Sutter Instrument Co.	P-97
2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament	Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm	FHC	27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl	Hamilton	80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe	Fisher Scientific	O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic	Becton Dickinson and Company (BD)	427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes	Becton Dickinson and Company (BD)	309657
Disposable 21 Gauge Needles	Becton Dickinson and Company (BD)	305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY611P3-2
Electrode Holder	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5	Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs	Office Depot	520-928
Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	23-400-101
Sterile filter tips