Перенос генов в Куриный органа по Слуховые<em> В Ово</em> Micro-электропорации
Summary
The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.
Abstract
Куриные эмбрионы являются идеальными модельные системы для изучения эмбрионального развития , как манипулирование функции генов может быть проведена с относительной легкостью в яйце. Внутреннее ухо слуховой сенсорный орган, имеет решающее значение для нашей способности слышать. В нем располагаются узкоспециализированный сенсорную эпителий, который состоит из клеток волос механико-преобразовательный (ГЦ) и окружающих глиальных как поддерживающие клетки (SCS). Несмотря на структурные различия в слуховых органах, молекулярные механизмы , регулирующие развитие слухового органа эволюционно консервативны у млекопитающих и Aves В ово электропорации в значительной степени ограничена на ранних стадиях E1 -. Е3. Из – за относительной позднего развития органа слуха при E5, манипуляциями слухового органа по ово в электропорации прошлом E3 затруднено ввиду опережающего развития куриного эмбриона на поздних стадиях. Метод, представленный здесь, является временным методом переноса гена для нацеливания генов, представляющих интерес вэтап Е4 – E4.5 в развивающемся куриной слуховом органа чувств с помощью в ово микро-электропорации. Этот метод применим для амплитудно и с потерей функции с экспрессирующих векторов на основе ДНК обычные плазмиды и могут быть объединены с в ово анализе пролиферации клеток путем добавления Эду (5-этинил-2'-дезоксиуридин) ко всему эмбриона на время электропорации. Использование зеленого или красного флуоресцентного белка (GFP или RFP) плазмид экспрессии позволяет экспериментатору быстро определить, успешно ли целевой электропорации слуховую часть проявляющего внутреннего уха. В этом методе бумаги, представительные примеры GFP электропорации образцов показаны; Эмбрионы собирали 18 – 96 ч после электропорации и адресности GFP к про-сенсорной области слухового органа была подтверждена РНК гибридизация. Метод бумаги также обеспечивает оптимизированную протокол для использования аналогам тимидина ОБР для анализа клеток Пролифжалюзей; пример на основе Edu анализа клеточной пролиферации, который сочетает в себе иммуно-маркировку и нажмите EDU химии обеспечивается.
Introduction
Несмотря на различия в морфологии и клеточных кучность между млекопитающих и птиц слуховом органа чувств, молекулярные факторы и пути , ответственные за развитие сенсорных HC , как полагают, эволюционно консервативны 1-3. Базилярной сосочка, в котором находится слуховой HCs и окружающих их ГКС, развивается как outpocketing внутреннего уха отоциста. Уже на раннем этапе пула HC и SC прародителей указана в ушные плакоды / ушные чашки нейронная-сенсорной области компетентного (НРД). Данные Судьба картированию свидетельствуют о том , что нейронные и сенсорные клоны связаны между собой и возникают из НРД , расположенной в передне-вентральной области ушные чашки или отоциста у мышей и цыплят 4,5. Во-первых, нейробласты вычленяются из НРД привести к нейронам слуховому-вестибулярный ганглий, который в конечном итоге расщепляется на слуховом и вестибулярном ганглиях. Эти нейроны иннервируют сенсорные HCs внутреннего уха и ядер в стволе мозга. Клетки-йпо-прежнему в НРД, как полагают, приводят к различным сенсорных участков, в том числе слухового органа чувств, состоящий из механико-преобразовательный сенсорных ГЦ и связанных с ними SCS.
В обоих кур и мышиным, орган слуха сенсорно прародитель выход из клеточного цикла и дифференцировки HC происходят в противоположных градиентов. У кур, слуховое прародитель выход из клеточного цикла начинается около ~ E5 и прогрессирует от основания к вершине, и от центра к периферии 6. Через день НС дифференциация начинается в вершине и прогрессирует к основанию 7. Изучение развития внутреннего уха у кур предоставляет множество технических преимуществ , как функциональные механизмы могут быть исследованы с относительной легкостью в яйце , в отличие от манипулирования эмбрионов в утробе матери и в других модельных системах, что требует сложных операций. Описанный здесь метод использует в ово микро-электропорации целевых генов , представляющих интерес в презумптивной basilaг площадь сосочек передне-вентрально в слуховым пузырьком конкретно в Е4.
Электропорация в яйце является метод , который хорошо известна и широко используется 8-14. Принцип метода электропорации основан на том факте , что нуклеотиды (например, плазмидная ДНК, синтетическую ДНК или РНК олигонуклеотиды) заряжены отрицательно. ДНК вводят в интересующую ткань. Когда электрический ток помещают поперек ткани, ток открывает переходные поры в клеточных стенках и обеспечивает поглощение ДНК, поскольку потоки отрицательно заряженная ДНК в направлении положительного электрода (анода). Для усиления из-функции экспериментов, представляющих интерес генов обычно субклонировали в экспрессирующие плазмиды, которые содержат соответствующие кассеты экспрессии для зеленого флуоресцентного белка (GFP) или красного флуоресцентного белка (RFP). Для потери из-функции экспериментов плазмиды на основе доминантных негативных конструкций репрессор или RNAi или морфолино конструкции сommonly использовали 15,16. Для подавления микроРНК (миРНК) Функция микроРНК губки конструкции, которые , как правило , плазмиду , на основе, могут быть использованы 17. Описанный здесь метод позволяет исследовать молекулярные механизмы , которые контролируют пролиферацию и дифференцировку в слуховом органе, как в ово методе микро-электропорации можно легко комбинировать с в ово анализе пролиферации клеток путем добавления Edu всему эмбриона.
Электропорации и добавление Эду выполняется на Е4 в слуховым пузырьком, который за один день до начала выхода из клеточного цикла в слуховом органе. Анализ органа слуха обычно проводят 18 – 96 ч после электропорации при E5 (Наступление сенсорных клеток-предшественников выхода из клеточного цикла), E6 (начало ХК дифференциации), и E7 (во время дифференцировки HC); а позже до ~ E9 (конец HC дифференциации). Этот метод электропорации переноса гена преходяще продолжительностью около ~ 4 дней, becauсебе гены интерес не интегрируются в геном, но этот метод применим для использования с подходящим плазмидных векторов экспрессии , основанных на ДНК, которые действительно имеют возможность интеграции в геном, такие как Tol2-опосредованного переноса гена 11. С помощью этого метода надежные GFP или RFP выражения длится ~ 4 дня в улитке, после чего указывают сигналы увядают, но обеспечивают достаточное окно времени, чтобы изучить запутанную развитие слухового органа. Это , в ово способе переноса генов является новым и позволяет конкретно целевой предположительный органа слуха при E4, который является оптимальным для исследований , которые сосредоточены на развитии HC в слуховом органе. Это является хорошим дополнением к альтернативным методам, которые электропорации на гораздо более молодых стадиях развития или 11,12 по сравнению с использованием в пробирке базилярной сосочков эксплантов культур 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь метод в ово микро-электропорации оптимизирован для переноса генов в развивающемся слуховом органе. Он совместим с экспрессирующими векторами на основе ДНК плазмиды обычно используются для манипулирования функции гена / экспрессии. Время проведения электропорац?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Дорис К. Ву для экспрессии плазмид и зондов измерений в точке, Университета имени Джона Хопкинса Центр Сенсорное объекта биологии визуализации и Центр слуха и равновесия. Эта работа была поддержана NIDCD Грант T32 DC000023 на LE
Materials
| Sterile 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | |
| Banana to Micrograbber Cable Kit | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 |
| Right Handed & Left Handed Micromanipulators | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L |
| Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts | World Precision Instruments Inc. | M10 |
| Metal Steel Base Plate 12×24 inch | World Precision Instruments Inc. | 5479 |
| Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors | World Precision Instruments Inc. | 14120 |
| Micropippette Puller for pulling needles | Sutter Instrument Co. | P-97 |
| 2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament | Sutter Instrument Co. | |
| Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 |
| Hamilton Glass Syringe 100 μl | Hamilton | 80601 Model 710LT |
| Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe | Fisher Scientific | O122-1 |
| Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand |
| 3 cc Disposable Syringes | Becton Dickinson and Company (BD) | 309657 |
| Disposable 21 Gauge Needles | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 |
| One pair of 2 mm Platinum Electrodes | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 |
| Electrode Holder | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 |
| One pair of Dumont fine forceps number 5 | Fine Science Tools (FST) | |
| Matte finish invisible tape for sealing eggs | Office Depot | 520-928 |
| Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 23-400-101 |
| Sterile filter tips |
References
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
- Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
- Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
- Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
- Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
- Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
- Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
- Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
- Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
- Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
- Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
- Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
- Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
- Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
- Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
- Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
- Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. , e306 (2007).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
- Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
- Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
