Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door<em> In Ovo</em> Micro-elektroporatie

Summary

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Abstract

Kippenembryo's zijn ideaal modelsystemen voor het bestuderen van de embryonale ontwikkeling manipulaties genfunctie kan worden uitgevoerd met relatief gemak in ovo. Het binnenoor auditieve zintuig is van cruciaal belang voor ons vermogen om te horen. Het herbergt een zeer gespecialiseerde sensorische epitheel, dat bestaat uit-mechanisch transduceren haarcellen (HC) en de omliggende glia-achtige ondersteunende cellen (SCS). Ondanks structurele verschillen in de auditieve organen worden moleculaire mechanismen reguleren van de ontwikkeling van het auditieve orgaan evolutionair geconserveerd tussen zoogdieren en Aves In ovo elektroporatie grotendeels beperkt tot beginfase E1 -. E3. Door de relatieve late ontwikkeling van het auditieve orgaan E5, manipulaties van het auditieve orgaan van in ovo elektroporatie verleden E3 moeilijk vanwege de gevorderde ontwikkeling van het kippenembryo in latere stadia. De hier gepresenteerde methode is een voorbijgaande genoverdracht methode voor het richten van genen van belang bijstadium E4 – E4.5 in de ontwikkelingslanden kip auditieve zintuig via in ovo micro-elektroporatie. Deze methode is toepasbaar voor gain en verlies-van-functie met conventionele plasmide-DNA-expressievectoren en kan worden gecombineerd met in ovo celproliferatie assay door toevoeging EDU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) om het hele embryo in de tijdstip van elektroporatie. De toepassing van groen of rood fluorescerend eiwit (GFP of RFP) expressieplasmiden kan de experimentator om snel te bepalen of de elektroporatie succes het auditieve gedeelte van het binnenoor ontwikkeling gericht. Bij deze werkwijze document, zijn representatieve voorbeelden van GFP geëlektroporeerd specimens geïllustreerd; embryo's werden geoogst 18-96 uur na elektroporatie en targeting van GFP aan de pro-sensorische gebied van het auditieve orgaan werd bevestigd door RNA in situ hybridisatie. De werkwijze papier verschaft ook een geoptimaliseerd protocol voor het gebruik van de thymidine analoog EDE cel Prolif analyserenking; Een voorbeeld van een EDU gebaseerd celproliferatie assay die immuno-labeling combineert en klik EDU chemie verschaft.

Introduction

Ondanks verschillen in morfologie en cellulaire patroonvorming tussen de zoogdieren en vogels auditieve zintuig, worden de moleculaire factoren en routes die verantwoordelijk zijn voor de sensorische HC ontwikkeling gedacht evolutionair geconserveerd ^1-3. De basilaire papilla, die de auditieve HK's en hun omgeving SC huizen, ontwikkelt zich als een outpocketing van het binnenoor otocyst. Vroeg op een pool van HC en SC voorlopers wordt opgegeven binnen de otic placode / otic cup neurale-zintuiglijke bevoegde domein (NSD). Fate-kaartgegevens leveren het bewijs dat de neuronale en sensorische lijnen zijn met elkaar verbonden en komen voort uit de NSD in de antero-ventrale regio van de otic beker of otocyst bij muizen en kippen ^4,5. Eerst, neuroblasts delamineren van de NSD invloed kunnen uitoefenen neuronen van de auditieve-vestibulaire ganglion, die uiteindelijk verdeeld auditieve en vestibulaire ganglia geven. Deze neuronen innerveren sensorische HC van het binnenoor en kernen in de hersenstam. De cellen thten blijven in de NSD wordt gedacht dat ze ontstaan ​​verschillende sensorische patches, waaronder de auditieve zintuig geven, bestaande uit de in mechanisch sensorische transductie HK's en de bijbehorende SC.

In zowel het kuiken en muizen, gehoororgaan sensorisch voorlopercellen celcyclus exit en HC differentiatie komen in tegengestelde gradiënten. In kuiken, auditieve progenitor celcyclus exit begint rond ~ E5 en vordert van de basis naar de top en van het centrum naar de periferie ^6. Eén dag later, HC differentiatie begint de apex en zich ontwikkelt tot de basis ^7. Het bestuderen van de ontwikkeling van het binnenoor van kip heeft vele technische voordelen als functionele mechanismen kunnen worden onderzocht met relatief gemak in ovo tegenover manipuleren van embryo's in de baarmoeder in andere modelsystemen die complexe operaties vereist. De hier beschreven methode gebruikt in ovo micro-elektroporatie genen van belang richten in de vermoedelijke basilar papilla gebied anterior-ventraal in de otic blaasje specifiek op E4.

Elektroporatie in ovo is een techniek die goed ingeburgerd en veelgebruikte ^8-14. Het principe van de electroporatie techniek is gebaseerd op het feit dat nucleotiden (bijvoorbeeld plasmide-DNA, synthetisch DNA of RNA oligonucleotiden) negatief geladen zijn. Het DNA wordt geïnjecteerd in het weefsel van belang. Wanneer een elektrische stroom wordt geplaatst in het weefsel, de huidige opent tijdelijke poriën in de celwanden en maakt de opname van het DNA, als negatief geladen DNA stroomt naar de positieve elektrode (anode). Voor gain-of-function experimenten worden genen van belang gewoonlijk gekloneerd in expressieplasmiden die geschikt expressiecassettes voor groen fluorescerend eiwit (GFP) of rood fluorescerend eiwit (RFP) bevatten. Voor loss-of-function experimenten plasmide gebaseerde dominant negatief repressor constructen, of RNAi, of morfolino constructen commonly gebruikt ^15,16. Om microRNA (miRNA) functie miRNAs spons constructen, die typisch gebaseerd plasmide remmen, kan worden gebruikt ^17. De hier beschreven werkwijze maakt het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die de proliferatie en differentiatie regelen in het auditieve orgaan, zoals de in ovo micro-elektroporatiewerkwijze gemakkelijk met in ovo celproliferatie assay kan worden gecombineerd door toevoeging EDE het hele embryo.

De elektroporatie en toevoeging van EDU wordt uitgevoerd bij E4 in het otische vesikel, één dag voor het begin van celcyclus exit in het auditieve orgaan. Analyse van het gehoororgaan is meestal uitgevoerd 18-96 uur na elektroporatie bij E5 (aanvang van zintuiglijke voorlopercellen celcyclus exit), E6 (begin van de HC differentiatie), en E7 (bij HC differentiatie); en later tot ~ E9 (einde van HC differentiatie). Dit elektroporatie methode van genoverdracht is van voorbijgaande aard blijvende ongeveer ~ 4 dagen, because de genen van belang niet integreren in het genoom, maar de methode is toepasbaar voor gebruik met geschikte plasmide-DNA-expressievectoren, die wel de mogelijkheid om te integreren in het genoom, zoals Tol2 gemedieerde genoverdracht ^11. Met deze methode robuuste GFP of RFP expressie duurt ~ 4 dagen in het slakkenhuis, waarna wijzen de signalen vervagen, maar toch zorgen voor een ruime tijd venster naar de ingewikkelde ontwikkeling van het gehoororgaan te bestuderen. Dit in ovo genoverdracht werkwijze is nieuw en maakt specifiek te richten de vermoedelijke gehoororgaan in E4, die optimaal is voor onderzoeken die gericht zijn op HC ontwikkeling in het auditieve orgaan. Het is een goede aanvulling op alternatieve werkwijzen die elektroporatie bij veel jongere ontwikkelingsstadia ^11,12 of vergelijking met het gebruik van in vitro basilaire papillae explantkweken ^18.

Protocol

De eieren en unhatched embryo's worden verzorgd en ethisch en humaan behandeld. Alle protocollen voor unhatched embryo gebruik werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite aan de Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland. 1. Eieren en Voorbereiding van de expressieconstructen eieren: Incubeer 3-4 dozijn bevruchte kippeneieren (Gallus gallus) plat op hun zij bij 37 ° C. Na 24 uur incubatie, trekken 3 cc eiwit …

Representative Results

Bij deze werkwijze paper plasmide-DNA bestaat uit groene fluorescent eiwit (GFP) expressiecassettes werd gericht in de ontwikkelende kippenembryo basilaire papilla (BP) met geoptimaliseerde parameters van 12 V en 4 pulsen van 100 msec pulsduur en intervallen van 200 msec, hetgeen een ~ 50% embryo overleving en de efficiëntie van plasmide-DNA te richten in het BP. Fluorescente beeldvorming van natief GFP expressie in ontwikkelende embryo's vertoonden deze wijze van elektroporatie voo…

Discussion

De hier beschreven werkwijze in ovo micro-elektroporatie is geoptimaliseerd voor genoverdracht naar de ontwikkeling auditieve orgaan. Het is compatibel met plasmide-DNA-expressievectoren doorgaans gebruikt om genfunctie / expressie manipuleren. De timing van elektroporatie op E4 optimaal voor onderzoeken die gericht zijn op HC ontwikkeling in het auditieve orgaan. De meest kritische stappen worden micro-injecteren van de DNA in de otic vesicle lumen zonder te diep met de naald en beschadiging van de otic blaasj…

Materials

Sterile 1x PBS pH 7.4	gibco	10010-023
Fast Green FCF Powder	Sigma	F7252-5G
EdU Powder	Invitrogen	E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit	Invitrogen	C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)	Qiagen	12643
ECM 830 ElectroSquarePorator	BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit	BTX Harvard Apparatus	45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators	World Precision Instruments Inc.	M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts	World Precision Instruments Inc.	M10
Metal Steel Base Plate 12×24 inch	World Precision Instruments Inc.	5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors	World Precision Instruments Inc.	14120
Micropippette Puller for pulling needles	Sutter Instrument Co.	P-97
2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament	Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm	FHC	27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl	Hamilton	80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe	Fisher Scientific	O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic	Becton Dickinson and Company (BD)	427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes	Becton Dickinson and Company (BD)	309657
Disposable 21 Gauge Needles	Becton Dickinson and Company (BD)	305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY611P3-2
Electrode Holder	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5	Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs	Office Depot	520-928
Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	23-400-101
Sterile filter tips