바이러스가 숙주 세포에 들어가는 동안 인플루엔자 A 바이러스 코어를 분해하는 것은 다단계 과정입니다. 우리는 바이러스 비코팅의 초기 단계를 분석하기 위한 시험관 내 방법을 설명합니다. 이 접근 방식에서는 속도 구배 원심분리를 사용하여 정의된 조건에서 코팅 해제를 시작하는 단계를 생화학적으로 해부합니다.
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이 논문에서
요약
초록
산에 의해 유발된 분자 과정은 내포세포계를 통해 들어오는 많은 바이러스의 세포 진입을 밀접하게 제어합니다. 인플루엔자 A 바이러스(IAV)의 경우, 엔도솜 막과의 바이러스 융합 및 바이러스 캡시드의 후속 분해(코팅되지 않음)는 내포성 소포 내부의 이온 조건에 의해 결정됩니다. 바이러스 수명 주기의 초기 단계는 엔도솜에 실험적으로 직접 접근할 수 없기 때문에 연구하기 어렵기 때문에 in vitro 접근 방식이 필요합니다. 여기에서는 IAV 코어와 그 안정성을 분석할 수 있는 2층 글리세롤 구배를 통한 정제된 비리온의 속도 구배 원심분리를 기반으로 하는 방법을 설명합니다. 구배는 하층에 비이온 세제(NP-40)를 함유하여 바이러스가 바닥으로 침전될 때 용해에 의해 바이러스 막을 제거합니다. 중성 pH에서 바이러스 코어는 안정적인 구조로 펠릿화됩니다. 주요 핵심 구성 요소인 매트릭스 단백질(M1)과 바이러스 리보핵단백질(vRNP)은 SDS-PAGE에 의해 펠릿 분획에서 명확하게 식별될 수 있습니다. 하단 층에서 pH를 6.0 이하로 낮추면 펠릿에서 M1이 선택적으로 제거된 후 더 산성 조건에서 vRNP가 방출됩니다. Coomassie-stained gel의 바이러스 단백질 띠는 IAV 분해의 중간 상태를 모니터링하기 위해 농도 측정 정량화를 수행할 수 있습니다. pH 외에도 염 농도 및 추정 바이러스 코팅 해제 인자와 같은 바이러스 코어 안정성에 영향을 미치는 다른 요인은 세제 함유 글리세롤 층을 적절하게 수정함으로써 간단히 평가할 수 있습니다. 종합하면, 제시된 기술을 통해 in vitro 바이러스 비코팅의 재현성이 높고 정량적인 분석이 가능합니다. 복잡한 코팅 제거 과정을 거치는 다른 외피 바이러스에 적용할 수 있습니다.
서론
인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 포락선 바이러스와 오르 쏘 믹소 바이러스과 (orthomixoviridae)의 가족에 속한다. 그 유전자는 세그먼트, 음의 감지 및 단일 가닥 RNA 게놈에 인코딩됩니다. 인간, IAV 계절 전염병의 발생에서 발생하는 호흡기 감염을 원인과 글로벌 전염병 일 가능성을 맺는다. 숙주 세포의 표면에이 시알 산 잔기에 결합하면, IAV는 클라 의존적 세포 내 이입 및 클라 독립 경로 3-8에 의해 내재화된다. 세포 내 이입 공포의 산성 환경 (PH <5.5) 바이러스의 융합과 후반 엔도 좀 막 9 초래 IAV 스파이크 당 단백질 헤 마글 루티 닌 (HA)의 주요 구조적 변화를 트리거합니다. 사이트 오 - IAV 캡시드되면 말 엔도 좀 (레),이 핵에 바이러스 리보 (vRNPs)의 전송 다음 세포질에 코팅되지 않은됩니다에서 탈출했다 (여기 또한 바이러스의 "핵심"이라한다)F 바이러스 복제 및 전사 10-13. HA 산의 활성화에 앞서 바이러스는 연속 14-16 분해 용 코어를 준비하게 이입 시스템에서 pH의 점차적 감소를 경험한다. 이 "프라이밍"양성자와 K +10,14,16의 유입을 매개 바이러스 막 중의 M2....
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프로토콜
버퍼 및 재고 솔루션 1. 준비
- 80 ML의 DDH 2 O.에 470 mg의 트리스 염산염 390 mg을 MES 수화물 580 mg의 NaCl을 용해하여 (20 MM의 MES, 30 mM 트리스, 100 mM의 염화나트륨)을 MNT 버퍼를 준비 pH를 7.4로 버퍼를 조정하고 DDH 2 O. 100 ml의 최종 부피로 가져
- 80 ml의 DH 2 O 각각에 9.76 g의 MES 수화물을 용해하여 500 mM의 MES 버퍼의 3 개의 동일한 솔루션을 준비합니다. 농축 된 NaOH로 적정하여 각각의 pH 5.8, 5.4, 5.0,에 버퍼를 조정합니다. DH 2 O. 100 ml의 최종 부피로 각 버퍼를 가지고
- DH 2 O 80 ㎖에 각각 7.88 g 트리스 염산에 용해시켜 500 mM 트리스 버퍼의 두 개의 동일한 솔루션을 준비하고 진한 HCl로 적정하여, 각각 7.4와 6.4로 pH를 조정합니다. DH 2 O. 100 ml의 최종 부피로 버퍼를 가지고
- DH 2 O 50 % 글리세롤 솔루션을 준비하고 glyc 때까지 잘 저어EROL는 균일하게 혼합이다. 유리 병으로 Steritop 필터 ....
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결과
이미 설명한 바와 같이, 엔도 좀에서 프라이밍 능력 uncoating IAV 코어를 렌더링하는 데 필요합니다. 코어의 양성자는 M1 및 vRNPs의 상호 작용을 약화 (바이러스 RNA, NP 구성을하고, 중합 효소 복합체 PB1 / PB2 / PA). 들어오는 바이러스 초기 엔도 좀 (EES) 6.5 (이하)의 pH에 노출 레 약 5.0의 pH에서의 바이러스 퓨즈까지 계속 될 때이 프로세스는 시작된다.
산도의 감소를 모방하기 위해, 글리세롤 구배 바닥층은 일정 염 농도에서 pH를 7.4 및 5.0 사이의 값으로 조정 하였다. 명확히 막액으로부터 유도 X31은 SDS-PAGE에 의해 속도 구배 원심 분리하여 분석 하였다 (도 2A, B). 패턴의 특징에 의해 반영된 바와 같이 경사
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토론
바이러스 캡시드는 준 안정 거대 분자 복합체이다. 비리의 어셈블리가 바이러스 게놈의 이입 및 응축을 필요로하지만, 감염의 다음 라운드의 시작이 소형 캡시드 구조의 해체에 따라 달라집니다. 바이러스는 세포 수용체, 보호자, 단백질 분해 효소, 모터 단백질 또는 헬리뿐만 아니라 pH와 이온 스위치 (26, 27)에 의해 제공되는 물리적 인 힘을 포함하는 코팅 - uncoating주기를 제어하는 다양한 세포 메커니즘을 악용 진화했다. 여기서는 구체적 IAV 코어의 분해를 촉진하는 요인의 영향을 테스트하기 위해, 글리세롤 구배 원심 분리에 기초한 시험 관내 방법을 설명한다. 이 기술은 잠재적으로 다른 외피 바이러스 uncoating 프로세스 해부하도록 구성 될 수있다.
콜로이드 쿠마, M1은, NP는, HA와 명확하더라도 비교적 작은 바이러스 partic하여 SDS-PAGE에서 검출 될 수있는 주요 구조물 IAV 단백질을 사용하여르 번호. 그러나,.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 시약으로 우리를 제공 요헤이 야마우치와 로버타 만치니 감사합니다. 아 연구소는 마리 퀴리 초기 교육 네트워크 (ITN)에 의해 지원되었다, 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 유럽 연구위원회 (ERC) (SINERGIA).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| cOmplete™, EDTA-free 프로테아제 억제제 정제 | Sigma-Aldrich | 11873580001 | 원액은 2 to 8 ° C 1에서 2주 동안 |
| 빙하 아세트산 | Merck Millipore | 100063 | |
| 글리세롤 무수 BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| 염산 | Merck Millipore | 100317 | |
| 긴 주사 바늘 (21 G, 9cm, 베벨 또는 무딘 끝) | |||
| MES 수화물 | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| 메탄올 | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | 현재 IGEPAL ®로 상업적으로 이용 가능; CA-630 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris 미니 젤, 10 웰, 1.0mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS 샘플 버퍼(4개) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE MOPS SDS 러닝 버퍼(20개) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH 지시자 스트립, pH 4.0-7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC 콜로이드 Coomassie 염색 | BIO RAD | 1610803 | |
| 나트륨 염화물 | Merck Millipore | 106406 | |
| 나트륨수산화물 | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop 필터 유닛 | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, 초원심분리 로터 세트 | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, 초투명 원심분리기 튜브, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 인플루엔자 A 바이러스 (H3N2), 계란 성장, 정화 된 알란토스 유체 | Virapur | 4 °에서 갓 해동; 씨 |
참고문헌
- Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza....
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재인쇄 및 허가
