Introduction
Virus influenzale A (IAV) è un virus con involucro e appartiene alla famiglia delle Orthomyxoviridae. I suoi geni sono codificati su un segmentato, negativo-senso e di genoma a singolo filamento di RNA. Negli esseri umani, IAV provoca infezioni respiratorie, che si verificano in epidemie stagionali e porta il potenziale di pandemie globali 1. Al legame con residui di acido sialico sulla superficie della cellula ospite 2, IAV è internalizzata per endocitosi clatrina-dipendente e le vie clatrina-indipendenti 3-8. L'acido ambiente (pH <5,5) nei vacuoli endocitici innesca un importante cambiamento conformazionale della IAV picco glicoproteina emoagglutinina (HA), che si traduce in fusione del virale e la fine della membrana 9 endosomal. Una volta che il capside IAV (qui noto anche come "core" virale) è sfuggito da endosomi ritardo (LES), è non rivestito nel citosol seguito dal trasporto dei ribonucleoproteine virali (vRNPs) nel nucleo - il sito oreplicazione del virus F e trascrizione 10-13. Prima all'attivazione acido HA del virus subisce una progressiva diminuzione del pH nel sistema endocitico, che innesca il nucleo per il suo successivo smontaggio 14-16. In questo "priming" passo i canali ionici M2 nella membrana virale mediare l'afflusso di protoni e K +10,14,16. La variazione della concentrazione ionica nell'interno virus disturba le interazioni costruire dal virale proteine della matrice M1 e gli otto vRNP fascio, e facilita IAV uncoating nel citoplasma seguente fusione della membrana 10,14-17.
Analisi diretta e quantitativa della fase di caricamento è stata ostacolata dal fatto che endosomi sono di difficile accesso sperimentalmente. Il processo di inserimento è inoltre altamente non sincrono. Inoltre, i test end-point, come qRT-PCR di misure di RNA o di infettività virale rilasciate, non forniscono un quadro dettagliato sullo stato biochimico del Capsi viraled in qualsiasi punto di entrata. Mentre perturbazione di endosomi di siRNA o trattamento farmacologico ha contribuito in modo significativo alla comprensione della IAV ingresso 18-20, messa a punto è difficile e soggetta a effetti collaterali non specifici nel programma endosome maturazione strettamente controllato.
Per evitare questi problemi, abbiamo adattato un protocollo precedentemente sviluppato in vitro basato sull'uso di gradiente di velocità di centrifugazione 17. A differenza di altri tentativi di 21,22, 23,24, che sono stati in gran parte basati su combinazioni di taglio proteolitico e il trattamento detergente seguita da analisi EM, questo approccio ha consentito un risultato facilmente quantificabile. Centrifugazione attraverso diversi strati gradiente permette alle particelle di sedimentazione per essere esposti e reagiscono con mutevoli condizioni in modo controllato. Nel protocollo presentato, IAV derivato dal liquido allantoico chiarito o particelle virali purificate sedimentate in una glicerolo a due stratigradiente in cui lo strato inferiore contiene il detergente non ionico NP-40 (Figura 1). Come il virus entra nel secondo strato, detergenti contenenti, i lipidi busta e busta glicoproteine virali sono delicatamente solubilizzate e lasciati alle spalle. Il nucleo, composto da otto vRNP fascio e circondato da uno strato di matrice, sedimenti come una struttura stabile nella frazione pellet. proteine essenziali virali, quali M1 e nucleoproteina vRNP-associato (NP), possono essere identificati in pellet mediante SDS-PAGE e colorazione Coomassie. In particolare, approfittando di gel gradiente disponibili in commercio e colorazione con l'colloidale altamente sensibile Coomassie 25, permette alta precisione e rilevamento di quantità anche minime di proteine essenziali associate virali.
Questo pone le basi per testare se le condizioni diverse, come il pH, la concentrazione di sale, e fattori uncoating putativi avere effetto sul comportamento di sedimentazione delle componenti di base e il nucleo stabil lità. A questo scopo, solo il strato detergenti contenenti più bassa nel gradiente di glicerolo viene modificato introducendo il fattore o condizione di interesse. La tecnica è stata particolarmente prezioso nelle indagini l'effetto di differenti valori di pH e concentrazioni saline sull'integrità del nucleo IAV 16. Passi intermedi di IAV uncoating potrebbero essere monitorati compresa dissociazione dello strato di matrice a pH leggermente acido (<6.5) seguita da vRNP dissociazione a pH 5,5 ed inferiore 16,17 (figura 1). Quest'ultima fase è stata ulteriormente potenziata dalla presenza di alta K + concentrazione nello strato di glicerolo, riflettendo un ambiente ritardo endocytic 16. Così, come il virus e il nucleo sedimentate attraverso il gradiente hanno sperimentato un ambiente che cambia che imita le condizioni in endosomi. Il risultato è stato uno smontaggio graduale del nucleo virale in vitro, integrando i risultati derivati da test di biologia cellulare.
t "> Il metodo presentato qui ha permesso veloce e analisi altamente riproducibile di IAV (X31 e A / WSN / 33) e IBV (B / Lee / 40) uncoating innescato da pH acido e aumentando K +16,17 così come lo smontaggio di core paramyxovirus su esposizione pH alcalino 17. Non si può escludere che l'approccio può essere adattato ad altri virus con involucro di acquisire conoscenze in proprietà biochimiche della struttura del capside virale e capside smontaggio durante l'immissione delle cellule.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione di Tamponi e soluzioni madre
- Preparare tampone MNT (20 mm MES, 30 mM Tris e 100 mm NaCl) sciogliendo 470 mg Tris cloridrato, 390 mg MES idratare e 580 mg di NaCl in 80 ml di DDH 2 O. Regolare il buffer a pH 7,4 e portarlo ad un volume finale di 100 ml con DDH 2 O.
- Preparare tre soluzioni identiche di 500 tampone mM MES sciogliendo 9,76 g MES idrato in 80 ml di dH 2 O ciascuno. Regolare i buffer a pH 5.8, 5.4 e 5.0, rispettivamente per titolazione con NaOH concentrato. Portare ogni buffer ad un volume finale di 100 ml con dH 2 O.
- Preparare due soluzioni identiche di 500 tampone Tris mM sciogliendo 7.88 g Tris cloridrato in 80 ml dH 2 O ciascuno e regolare il pH a rispettivamente 7,4 e 6,4,, per titolazione con HCl concentrato. Portare il buffer ad un volume finale di 100 ml con dH 2 O.
- Preparare la soluzione di glicerolo al 50% in DH 2 O e mescolare bene fino a quando il GLYCErol è omogeneamente misto. Filtrare la soluzione attraverso un gruppo di filtraggio Steritop (0,22 micron dimensioni dei pori) in una bottiglia di vetro.
- Preparare soluzione al 10% NP-40 e 1 M NaCl in DH 2 O.
- Preparare 25x inibitore della proteasi concentrata sciogliendo due compresse in 4 ml DDH 2 O.
2. Preparazione di glicerolo gradienti
- Preparare 5 ml di detersivo maestro tampone mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x concentrata inibitori della proteasi) soluzione per ogni condizione di pH a prova (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, e 5.0). A questo scopo, mescolare 9 ml di 1 M NaCl, 6 ml di 10% NP-40, 2,4 ml di inibitore della proteasi archivio 25x e 9 ml DDH 2 0.
- Per ogni condizione di pH pipetta 4,4 ml di master mix in un tubo conico da 50 ml.
- Per i valori di pH superiori a 5.8 aggiungere 0,6 ml del rispettivo pH aggiustato soluzione 500 mM Tris magazzino al tubo. Per pH 5,8 ed inferiore aggiungere 0,6 ml della rispettiva soluzione stock di 500 mm MES pH modificato.
- Fare 5ml di soluzione tampone contenente 300 mM NaCl, inibitore della proteasi 2x, 60 mM Tris a pH 7,4 e DDH 2 O. Questo servirà come il buffer di controllo del gradiente senza detersivo.
- Se necessario, fine-regolare il pH delle soluzioni a pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4 e 5.0 aggiungendo soluzioni HCI o NaOH concentrati rispettivamente.
- Aggiungere 5 ml di stock di glicerolo 50% a 5 ml della miscela tampone detergenti contenenti e senza detergenti risultanti in sei diverse soluzioni di glicerolo 25%. Verificare i valori di pH utilizzando strisce indicatrici pH.
NOTA: Nel caso in cui il pH misurato differisce significativamente dal valore desiderato, le rispettive soluzioni dovrebbero essere preparate di nuovo. - Preparare la soluzione di glicerolo al 15% mescolando 50% stock di glicerolo con dH 2 O in un rapporto 3: 7.
3. Ultracentrifugazione di IAV
- Aggiungere 3 ml di soluzione di glicerolo al 15% in tubi centrifugazione ultra chiare (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) utilizzando una siringa da 5 ml e una neeDLE (21 G, 9 cm di lunghezza). Non lasciare gocce alla parete interna del tubo in quanto questo potrebbe disturbare l'integrità del gradiente. Ripetere questo per un totale di sei tubi centrifugazione, uno per ciascuna delle cinque condizioni di pH per testare e uno per il campione di controllo.
- Posizionare con cura soluzione di glicerolo 3,4 ml di 25% sotto il livello di glicerolo 15% utilizzando una siringa da 5 ml e un lungo ago. Fare attenzione a non mescolare i due strati. Ripetere questa operazione per tutte le sei condizioni per testare con le rispettive soluzioni di glicerolo pH regolato.
NOTA: Il lavoro in classe II biosicurezza cabinet per i seguenti passaggi. - sovrapporre delicatamente i gradienti di glicerolo con 30 ml chiarito liquido allantoico contenente IAV (X31, H3N2) diluito in 1 ml MNT tampone (corrisponde a circa 20-30 mg di proteina virale totale) per ogni sfumatura.
- Equilibrio opposte tubi e metterli in un rotore ultracentrifugazione SW41. Centrifugare per 150 min, a 55.000 xg, e 12 ° C.
- Dopo la centrifugazione, accuratamenteRimuovere il surnatante, cioè, entrambi gli strati glicerolo utilizzando una pipetta Pasteur pulita e un aspiratore. Risospendere il pellet in 40 microlitri (1x) non riducenti tampone campione LDS. E 'importante pipettare su e giù più volte per sciogliere completamente il pellet. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
4. SDS-PAGE di pellet frazioni e Coomassie colorazione
- Riscaldare tutti i campioni a 95 ° C per 10 min. A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 ° C finché non vengono analizzati mediante SDS-PAGE.
- Carico 20 ml di pellet disciolti SU UN gradiente di pre-cast (4-12%) mini gel Bis-Tris e corrono per 1 ora a 200 V in 1x MOPS SDS tampone di corsa.
- Fai la soluzione fissazione con il 40% di metanolo e acido acetico glaciale al 10% in DDH 2 O.
- Incubare il gel in soluzione di fissaggio per 1 ora e macchiare notte in un 15 centimetri piatto di coltura cellulare con un volume sufficiente di soluzione colloidale Coomassie mentre delicatamenteagitazione a temperatura ambiente.
NOTA: È importante chiudere il piatto in modo da evitare l'evaporazione della soluzione colorante. - Decolorare il gel in DDH 2 O. Sostituire il DDH 2 O ogni 15-20 minuti fino a quando il fondo del gel diventa chiaro. Conservare il gel in DDH 2 O a 4 ° C fino a quando non viene sottoposto a scansione per la banda quantificazione.
- Eseguire la scansione del gel ad alta risoluzione e di utilizzare il software disponibile o su misura commercialmente per la quantificazione di intensità di banda proteine. Sottrarre il segnale di fondo da una regione vicino alle rispettive bande e normalizzare questi valori per i campioni di controllo senza detergente (a pH 7,4).
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Representative Results
Come già discusso, adescamento in endosomi è necessario per rendere il nucleo IAV uncoating competente. Protonazione del nucleo indebolisce interazione di M1 e vRNPs (composto di RNA virale, NP, e la polimerasi PB1 complesso / PB2 / PA). è iniziato questo processo quando il virus in arrivo è esposto ad un pH di 6,5 (o inferiore) in endosomi precoci (SEO) e continua fino a quando i fusibili virus in giro pH 5.0 a Les.
Per simulare la diminuzione del pH, lo strato inferiore dei gradienti di glicerolo sono stati adeguati valori compresi tra pH 7,4 e 5,0 ad una concentrazione di sale costante. X31 derivato dal liquido allantoico chiarificato è stato sottoposto a gradiente di velocità di centrifugazione e analizzati mediante SDS-PAGE (Figura 2A, B). Senza detersivo presenti nel gradiente (Figura 2A, lane1) virioni intatti sono in pellet, come risulta dal pattern caratteristicobande rappresentano HA (HA1 e HA2, 63 kDa), NP (56 kDa), e M1 (27 kDa) nella Coomassie macchiati gel. Dal momento che il gel è stato eseguito in condizioni di non ridurre, HA1 proteolytically spaccati e HA2 sono ancora collegati da legami disolfuro e corrono a circa 64 kDa. In condizioni riducenti la banda della HA1 e HA2 apparirebbero molto vicino alle bande NP e M1 rispettivamente, rendendo difficile interpretare fedelmente e determinare intensità di banda che sono esclusivamente derivate dal nucleo virale (Figura 2B).
Dopo aggiunta di NP-40 verso il basso (25%) di glicerolo strato dell'involucro virale compreso HA, NA e M2 sono stati solubilizzati e il nucleo virale sola sedimentato nel pellet durante ultracentrifugazione (Figura 1; la figura 2, corsia 2). Partendo con un pH inferiore a 6,5, M1 è progressivamente perso dalla frazione pellet, raggiungendo un minimo tra pH 5.8 e 5.4 (Figura2A, B). Sotto pH 5.8 vRNPs erano dissociate e quindi hanno perso dal pellet. In precedenza, è stato dimostrato che, di fatto, vRNPs interi vengono rilasciati nello strato superiore, come loro rilascio correlata con la perdita di PB2 dalla frazione pellet 16. Intensità banda proteica sono stati determinati, rivelando due soglie distinte pH per lo smontaggio dello strato M1 e la dissociazione dei fasci vRNP, rispettivamente (figura 2). bande addizionali potrebbero essere osservati sul gel, che potrebbe corrispondere alla proteine polimerasi PB1 (87 kDa), PB2 (86 kDa), PA (83 kDa), e M2 (11 kDa). Grazie alla loro numero di copie inferiori all'interno virioni IAV non siamo riusciti a determinare in modo affidabile la loro identità e non erano di conseguenza preso in considerazione per la quantificazione.
Figura 1: Rappresentazione schematica del IAV 
Figura 2: IAV nucleo smontaggio in vitro su acidificazione (A) In vitro smontaggio di core X31 in diverse condizioni di pH nello strato glicerolo inferiore.. Come controllo, NP-40 è stato omesso dallo strato inferiore glicerolo (prima corsia). I campioni sono stati separati mediante SDS-PAGE in condizioni non riducenti seguite da Coomassie colorazione. bande di proteine virali sono indicati sulla destra. (B) densitometrica quantificazione delle intensità delle bande proteiche virali indicate in (A). intensità banda proteica per M1 e NP sono stati normalizzati a quelli a pH 7.4 senza NP-40. I dati sono rappresentati come mezzo di esperimenti duplicati ± deviazione standard (SD). Adattato da Stauffer et al. 2014 16.ge.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
capsids virali sono metastabili complessi macromolecolari. Durante il montaggio del virioni richiede l'incapsidamento e condensazione del genoma del virus, l'inizio del prossimo ciclo di infezione dipende lo smontaggio di tale struttura capside compatta. I virus sono evoluti per sfruttare vari meccanismi cellulari per controllare il ciclo di verniciatura-uncoating, inclusi recettori cellulari, accompagnatori, enzimi proteolitici, forze fisiche fornite da proteine motrici o helicases nonché pH e interruttori ionici 26,27. Qui, descriviamo un metodo in vitro sulla base di una centrifugazione glicerolo sfumatura per testare specificamente l'effetto dei fattori che promuovono il disassemblaggio del nucleo IAV. La tecnica può essere potenzialmente adattato per sezionare i processi uncoating di altri virus con involucro.
Utilizzando colloidale Coomassie, le principali proteine strutturali IAV M1, NP, e HA può essere chiaramente individuato in SDS-PAGE anche con una relativamente piccola partic virusnumero di Le. Tuttavia, una caratterizzazione più approfondita della struttura capside sedimentato e la sua composizione richiederebbe follow-up analisi, ad esempio microscopia elettronica (come precedentemente presentata 28), Western blotting, light scattering dinamico o spettrometria di massa. Ulteriore estensione del protocollo potrebbe includere frazionamento (25%) Fase glicerolo inferiore e l'analisi dei componenti principali specifici.
Regolazione dello strato glicerolo inferiore per la fusione pH ottimale di 5,0 (per X31) ha portato ad una dissociazione quasi completa dello strato di matrice (Figura 2) 16. Tuttavia, circa il 30% del segnale NP ingresso può essere rivelato a questo pH. E 'possibile che a causa della assenza di fattori uncoating cellulari in questa configurazione, come recentemente identificato istone deacetilasi 6 (HDAC6) 18, si verifica lo smontaggio incompleta. All'interno della cellula, lenta acidificazione del nucleo virale e l'esposizione ad un interruttore da Na + a K + 16. Non possiamo escludere che nel nostro setup, il detergente non ionico interrompe parzialmente il nucleo acido-esposti e destabilizzato. Tuttavia, nessun effetto sul nucleo sedimenta a pH neutro è osservata indicato da simili intensità di banda proteica rispetto ai campioni non solubilizzato (Figura 2A, confrontare corsie 1 e 2). Sebbene, il saggio qui presentato dimostrato di essere altamente riproducibili e (come tale è) abbastanza robusto per banda quantificazione, potrebbe essere osservato un certo campo di variazione.
L'uso di glicerolo in questo protocollo è fondamentale per il risultato dell'esperimento. Come precedentemente riportato 17, ultracentrifugazione attraverso un gradiente di saccarosio destabilizza il nucleo IAV, che è probabilmente dovuto ad una elevata forza osmotica creato da saccarosio. Purificazione di IAV tramite gradienti di saccarosio potrebbe esercitare effetti simili. Perciò abbiamo confrontato uovo-grown X31 derivato da cl arified liquido allantoico e le scorte di saccarosio-purificata. Nessuna differenza importante potrebbe essere osservato rispetto alla influenza del pH acido sulla stabilità di base (dati non mostrati). Tuttavia, al fine di escludere i potenziali effetti collaterali del saccarosio osmoticamente attiva, si consiglia di eseguire il test in vitro uncoating con chiarito allantoidea supernatanti di coltura cellulare fluidi o concentrati.
Inoltre la scelta del materiale di gradiente, è importante mantenere l'integrità del gradiente di non influenzare il comportamento sedimentazione dei nuclei virali lisati e garantire risultati riproducibili. Inoltre, risospensione incompleta della frazione pellet dopo ultracentrifugazione probabile conduce a risultati diversi. Infine, suggeriamo vivamente regolando il pH delle soluzioni tampone detergenti contenenti idealmente lo stesso giorno dell'esperimento come piccoli cambiamenti nella concentrazione ionica potrebbero avere un effetto drastico sulla stabilità nucleo virale.
content "> E 'importante notare che a seconda del ceppo particolare IAV, efficienze diverse smontaggio potrebbero verificarsi in base alle proprietà del rispettivo M1 e NP varianti. Ciò può valere anche per virus mutanti. Quindi, soglie pH per strato di matrice e vRNP la dissociazione devono essere determinati per la rispettiva ceppo IAV prima di testare ulteriori influenze. per l'analisi delle condizioni specifiche in materia di stabilità del nucleo virale suggeriamo la regolazione del livello di glicerolo inferiore per un valore di pH in modo da ottenere lo smontaggio della metà-massimale di M1. E 'possibile per studiare l'influenza degli ioni specifici o agenti riducenti modificando il livello di detergente contenente conseguenza. putativi fattori uncoating cellulari possono essere aggiunti direttamente al gradiente di glicerolo. In caso di fattori citoplasmatici, un terzo strato di glicerolo al fondo del gradiente potrebbe essere introdotto, che viene portata a pH neutro, contiene il fattore cellulare di interesse, ed è libero di detersivo. In questo modo, the tre strati gradiente sarebbe ancora più strettamente imitare il passaggio del virus attraverso il sistema endocitico e rilascio di segmenti genici nel citoplasma neutra.Nel loro insieme, vi presentiamo un semplice ma robusto test in vitro per studiare IAV adescamento e uncoating, che ha il potenziale per modifiche versatili al fine di affrontare diverse questioni nel contesto di entrata IAV. Inoltre, può essere applicato per studiare processi di ingresso di altri virus incapsulati con meccanismi uncoating correlate.
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Acknowledgments
Ringraziamo Yohei Yamauchi e Roberta Mancini per averci fornito i reagenti. Il laboratorio AH è stato sostenuto dalle reti di formazione iniziale Marie Curie (ITN), il Consiglio europeo della ricerca (CER), e dal Fondo Nazionale Svizzero (Sinergia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0-7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4 °C |
References
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