जनरेशन और जीएम-सीएसएफ की पहचान व्युत्पन्न वायुकोशीय तरह मैक्रोफेज और वृक्ष के समान माउस अस्थि मज्जा से कोशिकाओं
Summary
Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
Abstract
मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) सहज प्रतिरक्षा ऊतकों और अंगों लसीकावत् कि रोगजनकों के खिलाफ रक्षा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा में पाया कोशिकाओं रहे हैं। हालांकि, वे पर्याप्त संख्या में अलग-थलग करने के लिए उन्हें विस्तार से अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो जाता है, इसलिए, इन विट्रो मॉडल विकसित किया गया है। अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं की इन विट्रो संस्कृतियों प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए अच्छी तरह से स्थापित और मूल्यवान तरीके हैं। इधर, संवर्धन और साइटोकाइन granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) का उपयोग प्राथमिक माउस अस्थि मज्जा की कोशिकाओं का एक ही संस्कृति से दोनों डीसी और मैक्रोफेज की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन किया है। इस प्रोटोकॉल की स्थापना की प्रक्रिया पहले लुट्ज़ एट अल द्वारा विकसित पर आधारित है। अस्थि मज्जा व्युत्पन्न DCs के लिए 1999 में। संस्कृति विषम है, और MHCII और fluoresceinated हयालूरोनान (FL-हा) अपरिपक्व और परिपक्व डीसी से मैक्रोफेज भेद करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। ये जीएम- CSF व्युत्पन्न मैक्रोफेज समर्थकइन विट्रो व्युत्पन्न मैक्रोफेज है कि निकट दोनों phenotype और समारोह में वायुकोशीय मैक्रोफेज के समान के लिए एक सुविधाजनक स्रोत ख़बरदार।
Introduction
कई इन विट्रो संस्कृति तरीकों अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDMs) और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न DCS (BMDCs) एक या विकास के कारकों के संयोजन का उपयोग उत्पन्न करने के लिए वर्णित किया गया है। BMDMs या तो बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) या जीएम- CSF 1,2 का उपयोग कर अस्थि मज्जा की कोशिकाओं संवर्धन द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। BMDCs के लिए, अस्थि मज्जा संस्कृति को FLT3 ligand के अलावा गैर पक्षपाती शास्त्रीय और plasmacytoid डीसी को जन्म (CD11c उच्च / MHCII उच्च और CD11c लो, B220 + क्रमशः) देता संस्कृति 3,4 9 दिनों के बाद। इसके विपरीत, गैर पक्षपाती कोशिकाओं अकेले जीएम- CSF 5,6 के साथ संस्कृति में 7 से 10 दिनों के बाद उत्पन्न, जीएम-सीएसएफ और आईएल 4 से 7, या जीएम- CSF और FLT3 ligand 8,9 उत्पन्न BMDCs अधिक बारीकी से भड़काऊ डीसी जैसी (CD11c उच्च, MHCII उच्च CD11b +) 10। इन विट्रो में संस्कृतियों मैक्रोफेज उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है याडीसी, यह स्पष्ट नहीं है, तो प्रत्येक संस्कृति शुद्ध आबादी को जन्म देता है। उदाहरण के लिए, हालांकि जीएम- CSF संस्कृतियों में पक्षपाती कोशिकाओं मैक्रोफेज 5, एक ही संस्कृति से गैर पक्षपाती कोशिकाओं डीसी 6,11-13 के रूप में उपयोग किया जाता है, अनुमान है कि वे सजातीय हैं और किसी भी मनाया परिवर्तनशीलता है साथ होने के लिए वर्णित हैं कारण विकास 14,15 के विभिन्न चरणों के लिए। इसके अलावा, अध्ययन विवो 16,17 में वायुकोशीय मैक्रोफेज के विकास के लिए एक आवश्यक विकास कारक हो जीएम- CSF पाया है, और वायुकोशीय तरह मैक्रोफेज 16,17,18 उत्पन्न करने के लिए इन विट्रो में इस्तेमाल किया जा सकता है।
पालन के अलावा, जीएम- CSF इलाज किया अस्थि मज्जा संस्कृतियों से मैक्रोफेज और DCS पैदा करने के लिए प्रक्रिया बहुत विविधता का सुझाव जीएम- CSF अस्थि मज्जा संस्कृतियों के भीतर मौजूद हो सकता है के समान हैं। यह वास्तव में के रूप में दो पत्र BMDC संस्कृतियों की गैर पक्षपाती अंश में BMDMs की उपस्थिति की रिपोर्ट का मामला प्रतीत हो रहा है। एक पत्र में, वे identifiप्रवर्तन निदेशालय के रूप CD11c +, CD11b +, MHCII मध्य, MerTK +, और CD115 +, जो एक जीन की अभिव्यक्ति के हस्ताक्षर है कि सबसे निकट वायुकोशीय मैक्रोफेज मची और टी कोशिकाओं 19 को सक्रिय करने के लिए एक कम क्षमता थी व्यक्त कोशिकाओं की आबादी। (CD11c +, MHCII मध्य / कम, फ्लोरिडा हा उच्च) कि अपरिपक्व से अलग किया गया था (CD11c +, MHCII मध्य, फ्लोरिडा हा कम) और परिपक्व दूसरे का इस्तेमाल किया MHCII और फ्लोरिडा हा कागज एक वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका की तरह जनसंख्या की पहचान करने के लिए DCS (CD11c +, MHCII उच्च), दोनों phenotypically और कार्यात्मक 18। इन पत्रों में दोनों उदाहरण देकर स्पष्ट करना है कि जीएम-सीएसएफ BMDC संस्कृतियों विषम हैं, दोनों मैक्रोफेज और उस देखभाल का संकेत है जब BMDC संस्कृतियों से डेटा की व्याख्या लिया जाना चाहिए डीसी आबादी से युक्त।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन अस्थि मज्जा, जीएम- CSF में संस्कृति अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए कैसे, और वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका तरह की पहचानअपरिपक्व और परिपक्व बंधन और MHCII अभिव्यक्ति FL-हा का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा अस्थि मज्जा संस्कृति में डीसी से आबादी। । यह प्रक्रिया लुट्ज़ एट अल 6 की स्थापना की प्रक्रिया पर आधारित है और 5 उत्पन्न करने में सक्षम है – 10 x 10 6 गैर पक्षपाती एक 10 मिलीलीटर संस्कृति के 7 दिन पर कोशिकाओं। संस्कृति दिनों से 7 से 10 प्रयोग करने योग्य है और 7. यह आगे बढ़ने और बड़ी मात्रा में अलग-थलग इन विट्रो वायुकोशीय तरह मैक्रोफेज के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है दिन में मैक्रोफेज, अपरिपक्व और परिपक्व DCs, साथ ही कुछ progenitors के एक विषम आबादी पैदावार।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में, हम एक माउस अस्थि मज्जा संस्कृति है कि लुट्ज़ एट अल। 6 से अनुकूलित है से जीएम- CSF व्युत्पन्न मैक्रोफेज और DCS पैदा करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं। MHCII अभिव्यक्ति और फ्लोरिडा हा इ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) (ग्रांट एमओपी 119,503) और कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग परिषद (NSERC) की कनाडा के संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था। NSERC भी गर्मियों studentships समर्थित यार्ड के लिए और ए.ए. वाई.डी. ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय (यूबीसी) एक 4 साल फैलोशिप पुरस्कार के साथ द्वारा समर्थित है, ए.ए. एक स्नातक छात्र मास्टर पुरस्कार (सीजीएस-एम) के साथ CIHR द्वारा समर्थित है। हम चित्रा 2 में छवियों को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के साथ सहायता के लिए केल्विन Roskelley धन्यवाद। हम यह भी यूबीसी पशु और से फ्लो सुविधाओं से समर्थन स्वीकार करते हैं।
Materials
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Richert | 1490 | |
| Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis–complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a ‘phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: ‘Exhausted’ or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
