Generatie en identificatie van GM-CSF Afgeleide alveolaire-achtige macrofagen en dendritische cellen van de muis beenmerg
Summary
Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
Abstract
Macrofagen en dendritische cellen (DCs) zijn aangeboren immuuncellen gevonden in weefsels en lymfoïde organen die een belangrijke rol bij de afweer tegen ziekteverwekkers spelen. Ze zijn echter moeilijk te isoleren voldoende aantallen te bestuderen in detail hebben dan ook in vitro modellen ontwikkeld. In vitro kweken van beenmerg afgeleide macrofagen en dendritische cellen zijn duurzaam en waardevolle werkwijzen voor immunologische studies. Hier wordt een werkwijze voor het kweken en identificeren van zowel DCs en macrofagen uit een kweek van primaire beenmergcellen van de muis met het cytokine granulocyt macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF) beschreven. Dit protocol is gebaseerd op de vastgestelde procedure ontwikkeld door Lutz et al. in 1999 voor het beenmerg afgeleide DCs. De cultuur is heterogeen en MHCII en fluoresceïne hyaluronan (HA-FL) worden gebruikt om macrofagen van onrijpe en rijpe DCs onderscheiden. Deze GM-CSF afgeleid macrofagen provide een geschikte bron van in vitro afgeleide macrofagen die lijken alveolaire macrofagen zowel fenotype en functie.
Introduction
Verscheidene in vitro kweekmethoden zijn beschreven beenmerg afgeleide macrofagen (BMDMs) en beenmerg afgeleide DCs (BMDCs) via een of een combinatie van groeifactoren genereren. BMDMs kunnen worden gegenereerd door het kweken van beenmergcellen behulp van macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) of GM-CSF 1,2. Voor BMDCs de toevoeging van FLT3 ligand aan het beenmerg kweek leidt tot niet-hechtende klassieke en plasmacytoïde DCs (CD11c high / MHCII hoog en CD 11 c lo, B220 + respectievelijk) na 9 dagen in kweek 3,4. Daarentegen vereist de niet-hechtende cellen gegenereerd na 7 tot 10 dagen in kweek met GM-CSF alleen 5,6, GM-CSF en IL-4 7 of GM-CSF en FLT3 ligand 8,9 genereren BMDCs meer gelijkenis vertonen inflammatoire DCs (CD 11 c hoog, MHCII hoog CD11b +) 10. Hoewel deze in vitro kweken worden gebruikt voor het maken of macrofagenDCs, het is onduidelijk of elke kweek ontstaat pure populaties. Hoewel bijvoorbeeld hechtende cellen in de GM-CSF kweken worden beschreven macrofagen 5, de niet-hechtende cellen van dezelfde cultuur gebruikt als DCs 6,11-13, met de veronderstelling dat ze homogeen zijn en alle waargenomen variabiliteit is door verschillende ontwikkelingsstadia 14,15. Verder hebben studies GM-CSF blijkt een essentiële groeifactor voor alveolaire macrofaag ontwikkeling in vivo 16,17, en kan worden gebruikt in vitro alveolaire macrofagen-achtige 16,17,18 genereren.
Anders dan hechting, de procedures voor het genereren van macrofagen en DC's van GM-CSF behandelde beenmerg culturen vergelijkbaar suggereren heterogeniteit kunnen bestaan in GM-CSF beenmergkweken. Dit lijkt inderdaad het geval twee papers rapporteren de aanwezigheid van BMDMs in de niet-hechtende fractie van BMDC culturen. In een paper, ze Identificaed een populatie van cellen CD 11 c + CD11b +, MHCII midden, MerTK + en CD115 +, die een gen expressie signatuur die het meest leek op alveolaire macrofagen en had een verminderd vermogen om T-cellen 19 activeren expressie. De tweede papier gebruikt MHCII en FL-HA een alveolaire macrofaag-achtige bevolking te identificeren (CD 11 c +, MHCII mid / laag, FL-HA hoog) die verschilt van onvolwassen was (CD 11 c +, MHCII medio, FL-HA laag) en volwassen DCs (CD 11 c +, MHCII hoog), zowel fenotypisch en functioneel 18. Deze papieren beide illustreren dat GM-CSF BMDC culturen zijn heterogeen, met zowel macrofagen en DC populatie aangeeft dat zorg moet worden genomen bij het interpreteren van gegevens uit BMDC culturen.
Dit protocol beschrijft hoe beenmerg, cultuur beenmergcellen in GM-CSF te isoleren en identificeren van de alveolaire macrofaag-achtigebevolking van de onrijpe en rijpe DCs in het beenmerg cultuur door middel van flowcytometrie met behulp van FL-HA-bindend en MHCII expressie. Deze procedure is gebaseerd op de vastgestelde procedure van Lutz c.s. 6 en kan genereren 5 -. 10 x 10 6 niet-hechtende cellen op dag 7 van 10 ml kweek. De cultuur is bruikbaar vanaf dagen 7-10 en levert een heterogene populatie van macrofagen, onrijpe en rijpe DCs, evenals een aantal voorlopers op dag 7. Dit is een eenvoudige werkwijze om te groeien en te isoleren in vitro alveolaire-achtige macrofagen in grote hoeveelheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit manuscript, bieden we een werkwijze voor het GM-CSF macrofagen en DCs uit een enkele muis beenmerg cultuur die is aangepast van Lutz et al. 6. MHCII expressie en FL-HA binding maakt onderscheid tussen onrijpe DCs en macrofagen in deze cultuur (zie figuur 3C), die voorheen moeilijk is geweest. Dit, samen met een ander verslag Helft et al. 19, illustratie heterogeniteit in GM-CSF geïnduceerde BMDC culturen die voorheen gedacht alleen DCs zijn. Helft et a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (Grant MOP-119.503) en het Natural Sciences and Engineering Council van Canada (NSERC). NSERC ook ondersteund zomer studentships te YD en AA YD wordt ondersteund door de Universiteit van British Columbia (UBC) met een 4-jaar Fellowship Award, wordt AA ondersteund door CIHR met een afgestudeerde student Master award (CGS-M). Wij danken Calvin Roskelley voor hulp bij de microscoop gebruikt om de beelden in figuur 2 te genereren. We hebben ook steun van de UBC Animal en flowcytometrie voorzieningen te erkennen.
Materials
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Richert | 1490 | |
| Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis–complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a ‘phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: ‘Exhausted’ or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
