Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea
Summary
Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
Abstract
Os macrófagos e as células dendríticas (CDs) são células imunes inatas encontradas em tecidos e órgãos linfóides, que desempenham um papel fundamental na defesa contra agentes patogénicos. No entanto, eles são difíceis de isolar em quantidade suficiente para estudá-los em pormenor, por conseguinte, os modelos in vitro têm sido desenvolvidos. Culturas in vitro de osso derivadas de medula macrófagos e células dendríticas são bem estabelecidos e métodos úteis para estudos imunológicos. Aqui, um método para a cultura e identificação de ambas as DCs e macrófagos a partir de uma única cultura de células da medula óssea primário do rato utilizando o factor de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos de citocinas (GM-CSF) é descrita. Este protocolo é baseado no procedimento estabelecido pela primeira vez desenvolvido por Lutz et al. em 1999 para DCs derivadas de medula óssea. A cultura é heterogênea, e MHCII e ácido hialurônico fluoresceína (FL-HA) são usadas para distinguir macrófagos de DCs imaturos e maduros. Estes GM-CSF macrófagos derivados próvide uma fonte conveniente de macrófagos derivados in vitro que se assemelham estreitamente macrófagos alveolares em ambos fenótipo e função.
Introduction
Vários métodos de cultura in vitro foram descritas para gerar macrófagos de osso derivadas de medula (BMDMs) e DCs derivadas da medula óssea (BMDCs) utilizando um ou uma combinação de factores de crescimento. BMDMs pode ser gerado através da cultura de células da medula óssea utilizando um factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF) ou GM-CSF a 1,2. Para BMDCs, a adição de ligando de FLT3 para a cultura de medula óssea dá origem a DCs clássicos e plasmocitoides não aderentes (CD11c alta MHCII alta e CD11c Lo /, B220 +, respectivamente), após 9 dias de cultura em 3,4. Em contraste, células não-aderentes gerado após 7 a 10 dias em cultura com GM-CSF sozinho 5,6, GM-CSF e IL-4 7, ou GM-CSF e o ligando de FLT3 8,9 gerar BMDCs assemelha-se mais estreitamente DCs inflamatórias (alta CD11c, CD11b MHCII alta +) 10. Embora estas culturas in vitro são utilizados para gerar ou macrófagosDCs, não é claro se cada cultura dá origem a populações puras. Por exemplo, embora as células aderentes nas culturas de GM-CSF são descritos para ser macrófagos 5, as células não aderentes a partir da mesma cultura são utilizados como DCs 6,11-13, com o pressuposto de que eles são homogéneos e qualquer variabilidade observada é devido a diferentes fases do desenvolvimento 14,15. Além disso, estudos têm encontrado GM-CSF a ser um factor de crescimento essencial para o desenvolvimento de macrófagos alveolares in vivo 16,17, e pode ser utilizado in vitro para gerar macrófagos alveolares do tipo 16,17,18.
Para além de adesão, os procedimentos para a produção de macrófagos e células dendríticas a partir de GM-CSF tratado culturas de medula óssea são muito semelhantes, sugerindo heterogeneidade pode existir dentro de GM-CSF culturas de medula óssea. Este facto parece ser o caso, como dois trabalhos relatam a presença de BMDMs na fracção não-aderente de culturas BMDC. Em um papel, que identified uma população de células como CD11c +, CD11b +, MHCII mid, MerTK + e CD115 +, que expressa uma assinatura a expressão de genes que se assemelhava mais estreitamente macrófagos alveolares e tinha uma capacidade reduzida de activar células T 19. O segundo papel utilizado MHCII e FL-HA para identificar uma população de macrófagos-like alveolar (CD11c +, MHCII média / baixa, FL-HA alta), que era distinta da imaturo (CD11c +, MHCII mid, FL-HA baixo) e madura DCs (CD11c +, MHCII alta), tanto fenotipicamente e funcionalmente 18. Estes papéis ambos ilustram que as culturas GM-CSF BMDC são heterogêneas, contendo tanto populações DC, indicando que deve ser tomado cuidado ao interpretar os dados a partir de culturas BMDC macrófagos e.
Este protocolo descreve como isolar medula óssea, as células de medula óssea de cultura em GM-CSF, e identificar o macrófago alveolar semelhantepopulação dos DCs imaturos e maduros na cultura de medula óssea por citometria de fluxo utilizando FL-HA de ligação e expressão MHCII. Este procedimento é baseado no procedimento estabelecido de Lutz et ai 6 e é capaz de gerar 5 -. 10 X 10 6 células não aderentes no dia 7 de uma cultura de 10 ml. A cultura é utilizável a partir de 7 a 10 dias e produz uma população heterogénea de macrófagos, DC imaturas e maduras, bem como alguns progenitores no dia 7. Isto proporciona um método simples para isolar e cultivar in vitro macrófagos alveolares semelhantes em grandes quantidades.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, é proporcionado um método para a geração de macrófagos e células dendríticas derivadas de GM-CSF a partir de uma única cultura de medula óssea de ratinho que é adaptado de Lutz et ai. 6. Expressão MHCII e FL-HA distingue entre DC imaturas e macrófagos de ligação nesta cultura (ver Figura 3C), que anteriormente tem sido difícil. Isto, juntamente com outro relatório Helft et al. 19, demonstra a heterogeneidade dentro de GM-CSF induzidas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) (Grant MOP-119503) e do Conselho Ciências e Engenharia Natural do Canadá (NSERC). NSERC também apoiou studentships de verão para YD e AA YD é apoiado pela Universidade de British Columbia (UBC), com uma bolsa de estudos de 4 anos, AA é suportado por CIHR com a atribuição de um estudante de graduação do Master (CGS-M). Agradecemos Calvin Roskelley para assistência com o microscópio usado para gerar as imagens na Figura 2. Também reconhecemos o apoio dos animais e citometria de fluxo Instalações UBC.
Materials
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Richert | 1490 | |
| Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis–complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a ‘phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: ‘Exhausted’ or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
