דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם
Summary
Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
Abstract
המקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCS) הם תאים חיסוניים מולדים נמצא ברקמות ואיברים הלימפה כי לשחק תפקיד מפתח בהגנה מפני פתוגנים. עם זאת, הם קשים לבודד בכמות מספקת כדי ללמוד אותם בפירוט, ולכן, במבחנת מודלים פותחו. בתרבויות במבחנה של מקרופאגים עצם שמקורם במח ותאי דנדריטיים הם ומבוססים ושיטות בעל ערך עבור מחקרים אימונולוגית. כאן, שיטת culturing וזיהוי הוא DCS ו מקרופאגים מתרבה אחת של תאים במח עצם עכבר העיקרי באמצעות גורם מגרת מושבת מקרופאג גרנולוציט ציטוקינים (GM-CSF) מתוארת. פרוטוקול זה מבוסס על ההליך הוקם ראשון שפותח על ידי ואח 'לוץ. בשנת 1999 עבור DCs עצם שמקורם במח. התרבות היא הטרוגנית, הכוללת MHCII ו hyaluronan fluoresceinated (FL-HA) משמשים כדי להבחין מקרופאגים DCs בשלה ובוגרת. GM-CSF אלה מתקבלים מקרופאגים פרוvide מקור נוח של מקרופאגים נגזר במבחנה כי הדומים מקרופאגים מכתשיים בשני הפנוטיפ ותפקוד.
Introduction
כמה בשיטות תרבות במבחנה תוארו ליצור מקרופאגים עצם שמקורם במח (BMDMs) ו DCs עצם שמקורם במח (BMDCs) באמצעות אחד או שילוב של גורמי גדילה. BMDMs יכול להיווצר על ידי culturing תאים במח העצם או באמצעות גורם מגרה המושבה מקרופאג (M-CSF) או GM-CSF 1,2. לקבלת BMDCs, תוספת של ליגנד FLT3 לתרבות מח עצם מוליד DCs קלאסית plasmacytoid לא חסיד (CD11c גבוה / גבוהה CD11c MHCII lo, B220 + בהתאמה) לאחר 9 ימים בתרבות 3,4. לעומת זאת, תאים שאינם חסידים שנוצרו לאחר 7 עד 10 ימים בתרבות עם GM-CSF לבד 5,6, GM-CSF ו- IL-4 7, או GM-CSF ו FLT3 ליגנד 8,9 ליצור BMDCs יותר מקרוב דומת DCs הדלקתית (גבוה CD11c, MHCII גבוהה CD11b +) 10. בעוד תרבויות חוץ גופית אלה משמשים ליצירת מקרופאגים אוDCS, לא ברור אם כל תרבות מולידה אוכלוסיות טהורות. לדוגמא, אם כי תאים חסידים בתרבויות-CSF GM מתוארים להיות מקרופאגים 5, התאים לא חסידים מאותה התרבות משמשים DCs 6,11-13, עם ההנחה כי הם הומוגנית וכל השתנות שנצפתה היא עקב שלבי ההתפתחות השונים 14,15. יתר על כן, מחקרים מצאו GM-CSF כדי להוות גורם צמיחה חיוני להתפתחות מקרופאג המכתשית in vivo 16,17, וניתן להשתמש במבחנה כדי לייצר מקרופאגים מכתשיים דמוי 16,17,18.
מלבד דבקות, הנהלים להפקה מאקרופאגים DCs ממח עצם מטופלים-CSF GM תרבויות דומים מאוד המצביע על ההטרוגניות יכול להתקיים בתוך תרבויות מח עצם GM-CSF. זה אכן נראה את המקרה כפי שני מסמכים לדווח על נוכחות של BMDMs בשבריר לא חסיד של תרבויות BMDC. במאמר אחד, הם identified אוכלוסייה של תאים כמו CD11c +, CD11b +, באמצע MHCII, MerTK +, ו CD115 +, אשר הביע חתימה ביטוי גנים שדמה יותר מכול מקרופאגים מכתשיים והיה לו יכולת מופחתת להפעיל תאי T 19. המאמר השני בשימוש MHCII ו FL-HA לזהות אוכלוסייה המכתשית מקרופאג דמוי (+ CD11c, MHCII אמצע / נמוך, FL-HA גבוהה) כי היה נבדל לא מפותחים (+ CD11c, MHCII באמצע, FL-HA נמוך) ובוגרת DCS (CD11c +, MHCII גבוהה), הן phenotypically והן מבחינה תפקודית 18. שני העיתונים הללו ממחישים כי GM-CSF תרבויות BMDC הן הטרוגניים, המכילים את שני מקרופאג ואוכלוסיות DC המציין טיפול שיש לנקוט כאשר לפרש נתונים מתרבויות BMDC.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד מח עצם, תאי מח עצם התרבות GM-CSF, ולזהות את מכתשי מקרופאג דמויהאוכלוסייה מן DCs בשלה ובוגרת בתרבות מח העצם על ידי cytometry זרימה באמצעות FL-HA מחייב וביטוי MHCII. הליך זה מבוסס על הליך הוקמה של לוץ ואח 6 והוא מסוגל לייצר 5 -. 10 x 10 6 תאים לא חסיד ביום 7 של תרבות 10 מ"ל. התרבות היא שמיש מימים 7 עד 10 ומניבת אוכלוסייה הטרוגנית של מקרופאגים, DCS בשלה ובוגרת, כמו גם אבות חלקים ביום 7. זה מספק שיטה פשוטה לגדול ולבודד במבחנה המכתשית דמוי מקרופאגים בכמויות גדולות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב היד הזה, אנו מספקים שיטה להפקת מקרופאגים GM-CSF נגזר DCs מתרבה מח עצם עכבר אחת כי הוא עיבוד לוץ et al. 6. ביטוי MHCII ו FL-HA מחייב מבחינה בין DCs בשלה מקרופאגים בתרבות זו (ראו איור 3 ג), אשר בעבר כבר קשה. זה, יחד עם דו"ח נוסף על ידי Helft et al. 19, הדגים הט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) (גרנט MOP-119,503) ואת למדעי הטבע וההנדסה המועצה של קנדה (NSERC). NSERC גם נתמך studentships הקיץ י"ד ו- AA י"ד נתמך על ידי אוניברסיטת קולומביה הבריטית (UBC) עם פרס המילגה 4 שנים, AA נתמך על ידי CIHR עם פרס שני סטודנט לתואר שני (CGS-M). אנו מודים קלווין Roskelley לסיוע עם מיקרוסקופ השתמשו כדי ליצור את התמונות באיור 2. כמו כן, אנו מכירים תמיכה מן מתחם Cytometry Animal ושפל UBC.
Materials
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Richert | 1490 | |
| Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis–complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a ‘phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: ‘Exhausted’ or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
