マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定
Summary
Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
Abstract
マクロファージや樹状細胞（DC）は、病原体に対する防御において重要な役割を果たしている組織やリンパ器官に見られる先天性免疫細胞です。しかし、それらは、それらを詳細に研究するために十分な数に分離することが困難であるため、 インビトロモデルが開発されている。骨髄由来マクロファージおよび樹状細胞のインビトロ培養物の免疫学的研究のための十分に確立され、有益な方法です。ここで、培養およびサイトカイン顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を用いて、一次マウス骨髄細胞の単一培養物からのDCおよびマクロファージの両方を同定するための方法が記載されています。このプロトコルは、最初のルッツらによって開発された確立された手順に基づいています。骨髄由来DCの1999インチ文化は不均一であり、かつMHCIIおよび蛍光標識ヒアルロン酸（FL-HA）は、未成熟および成熟DCからマクロファージを区別するために使用されます。プロこれらのGM-CSF由来のマクロファージ密接に表現型および機能の両方に肺胞マクロファージに似ているインビトロ由来のマクロファージの便利な供給源を見よ。
Introduction
いくつかのin vitroでの培養方法は、骨髄由来マクロファージ（BMDMs）と1つの成長因子の組み合わせを使用して、骨髄由来DC（BMDCを）を生成することが記載されています。 BMDMsは、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、またはGM-CSF 1,2のいずれかを使用して骨髄細胞を培養することによって生成することができます。 BMDCのために、骨髄文化へのFLT3リガンドの添加は、培養3,4で9日後（ 高およびCD11c 見よ 、それぞれB220 + CD11cの高い / MHCII）非接着古典と形質DCに上昇を与えます。対照的に、GM-CSFと培養7〜10日後に生成された、非接着細胞単独5,6-、GM-CSFおよびIL-4 7、またはGM-CSFおよびFLT3リガンド8,9より密接炎症性DCを似たBMDCを生成（ 高いのCD11c、MHCII 高のCD11b +）10。これらのインビトロ培養は、マクロファージを生成するために使用されている間に各培養物は純粋な集団を生じさせる場合DCは、それは不明です。例えば、GM-CSF培養中の接着細胞は、それらが均質であり、任意の観察された変動がある推定でマクロファージ5、DCを6,11-13として使用されるのと同じ培養物からの非付着細胞であることが記載されているものの開発14,15の異なる段階に起因します。さらに、研究は、 インビボ 16,17 における肺胞マクロファージの発達のために必須の増殖因子であるGM-CSFを発見し、そして肺胞マクロファージ様16,17,18を生成するためにインビトロで使用することができます。
付着以外は、GM-CSF処理した骨髄培養物からのマクロファージ及び樹状細胞を生成するための手順は、GM-CSFの骨髄培養物内に存在し得る不均質性を示唆している非常に類似しています。これは、実際に2つの論文は、BMDC培養物の非付着画分におけるBMDMsの存在を報告としてケースのように思われます。 1論文で、彼らはidentifi最も密接に肺胞マクロファージに似ていたし、T細胞19を活性化する能力が低下していた遺伝子発現特性を発現したCD11c +、のCD11b +、MHCII 半ば 、MERTK +、およびCD115 +、などの細胞の集団を編。未熟（たCD11c +、MHCII 半ば 、 低 FL-HA）および成熟異なっていた肺胞マクロファージ様人口を識別するために、MHCIIとFL-HAを使用する第二の紙（たCD11c +、 ミッド/ロー MHCII、FL-HA 高 ）樹状細胞（のCD11cの+、 高 MHCII）、両方の表現型および機能的に18。これらの論文は、GM-CSF BMDC培養が不均一であることを示してBMDC培養物からのデータを解釈する際には注意すべきであることを示すマクロファージおよびDC集団の両方を含む両方。
このプロトコルは、骨髄、GM-CSFでの培養骨髄細胞を分離し、肺胞マクロファージ様を識別する方法について説明します結合およびMHCII発現FL-HAを使用して、フローサイトメトリーによる骨髄培養における未成熟および成熟DCから人口。 。この手順は、6ルッツらの確立された手順に基づいており、5生成することができるされている- 10ミリリットルの培養7日目に10×10 6非接着細胞を。文化は日から7〜10に使用可能であり、7日目これが成長し、大量にインビトロ肺胞のようなマクロファージを単離するための簡単な方法を提供するでマクロファージ、未成熟および成熟DC、だけでなく、いくつかの前駆細胞の不均一な集団を生成します。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、我々はルッツら 6から採用された単一のマウス骨髄培養からGM-CSF由来のマクロファージや樹状細胞を生成する方法を提供します。この培養中の未成熟DCおよびマクロファージを区別する結合MHCII発現およびFL-HAは、以前は困難であった、（ 図3Cを参照します）。これは、一緒にHelft ら 19による別のレポートで、以前はDCのみであると考えられ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ヘルスリサーチ（CIHR）（グラントMOP-119503）とカナダの自然科学・工学評議会（NSERC）のカナダの研究所によって資金を供給されました。 NSERCもYDする夏のstudentshipsをサポートし、AA YDは、4年間のフェローシップ賞とブリティッシュコロンビア大学（UBC）によってサポートされ、AAは、大学院生の修士賞（CGS-M）とCIHRでサポートされています。我々は、 図2の画像を生成するために使用される顕微鏡の支援のためにカルバンRoskelleyに感謝します。我々はまた、UBC動物とフローサイトメトリー施設からの支援を認めます。
Materials
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Richert | 1490 | |
| Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
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