جيل وتحديد GM-CSF المشتقة مثل السنخية الضامة والخلايا الجذعية من الفأر نخاع العظم
Summary
Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
Abstract
الضامة والخلايا الجذعية (DCS) هي خلايا المناعة الفطرية الموجودة في الأنسجة والأعضاء اللمفاوية التي تلعب دورا رئيسيا في الدفاع ضد مسببات الأمراض. ومع ذلك، فهي من الصعب عزل بأعداد كافية لدراستها بالتفصيل، لذلك، وضعت في المختبر النماذج. في المختبر ثقافات العظام الضامة المشتقة من نخاع والخلايا الجذعية هي طرق قيمة راسخة والدراسات المناعية. هنا، يتم وصف طريقة لزراعة وتحديد كل من البلدان النامية والضامة من ثقافة واحدة من خلايا نخاع العظام باستخدام الأساسي خلوى محببة بلعم عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF). ويستند هذا البروتوكول على إجراءات المتبعة أول من وضعه لوتز وآخرون. في عام 1999 للعظام البلدان النامية المشتقة من نخاع. الثقافة هي غير متجانسة، وتستخدم MHCII وحمض الهيالورونيك fluoresceinated (FL-HA) للتمييز الضامة من البلدان النامية غير الناضجة والناضجة. تستمد هذه GM-CSF الضامة المواليةبنصيحة مصدر مناسب من الضامة في المختبر المشتقة التي تشبه البلاعم السنخية في كل من النمط الظاهري وظيفة.
Introduction
وقد وصفت العديد من الطرق الثقافة في المختبر لتوليد العظام الضامة المشتقة من نخاع (BMDMs) والعظام البلدان النامية المشتقة من نخاع (BMDCs) باستخدام واحد أو مزيج من عوامل النمو. BMDMs يمكن توليدها عن طريق زراعة خلايا نخاع العظام باستخدام إما بلعم مستعمرة عامل تحفيز (M-CSF) أو GM-CSF 1،2. لBMDCs، إضافة FLT3 يجند للثقافة نخاع العظام يثير البلدان النامية الكلاسيكية وبلازماوية الشكل غير ملتصقة (CD11c وعالية / MHCII عالية وCD11c والصغرى، B220 + على التوالي) بعد 9 أيام في الثقافة 3،4. في المقابل، الخلايا غير ملتصقة ولدت بعد 7-10 أيام في الثقافة مع GM-CSF وحدها 5،6، GM-CSF و IL-4 7، أو GM-CSF وFLT3 يجند 8،9 توليد BMDCs تشبه عن كثب البلدان النامية التهابات (الأعلى CD11c و، MHCII مرتفعة CD11b +) 10. في حين تستخدم هذه في المختبر الثقافات لتوليد الضامة أوالبلدان النامية، فمن غير الواضح إذا كان كل ثقافة يثير مجموعات نقية. على سبيل المثال، على الرغم من وصفها الخلايا الملتصقة في الثقافات GM-CSF أن يكون الضامة 5، الخلايا غير ملتصقة من نفس الثقافة وتستخدم البلدان النامية 6،11-13، مع افتراض أنها متجانسة وأي تقلب ملاحظتها نظرا لمراحل مختلفة من التنمية 14،15. وعلاوة على ذلك، وقد وجدت الدراسات GM-CSF لانه عامل نمو أساسي للتنمية البلاعم السنخية في الجسم الحي 16،17، ويمكن استخدامها في المختبر لتوليد الضامة مثل السنخية 16،17،18.
البعض من الالتزام، والإجراءات لتوليد الضامة والبلدان النامية من GM-CSF تعامل الثقافات نخاع العظم هي مشابهة جدا مما يشير إلى عدم التجانس قد تكون موجودة داخل GM-CSF الثقافات نخاع العظام. هذا يبدو في الواقع أن هذا هو الحال كما أفادت ورقتين وجود BMDMs في جزء غير ملتصقة الثقافات BMDC. في ورقة واحدة، فإنها identifiإد يبلغ عدد سكانها الخلايا كما CD11c و+، CD11b +، MHCII منتصف، MerTK +، وCD115 +، الذي أعرب عن التعبير توقيع الجينات التي تشبه كثيرا الضامة السنخية وكان انخفاض القدرة على تنشيط خلايا T 19. الورقة الثانية تستخدم MHCII وFL-HA لتحديد السكان مثل بلعم السنخية (CD11c و+، MHCII منتصف / منخفضة، وارتفاع FL-HA) التي كانت متميزة من غير ناضجة (CD11c و+، MHCII منتصف، FL-HA منخفض) وناضجة البلدان النامية (CD11c و+، MHCII عالي)، سواء ظاهريا وظيفيا 18. توضح هذه الأوراق على حد سواء أن الثقافات GM-CSF BMDC غير متجانسة، تحتوي على كل بلعم وسكان العاصمة مشيرا إلى أن ينبغي الحرص عند تفسير البيانات من الثقافات BMDC.
يصف هذا البروتوكول كيفية عزل نخاع العظم، خلايا نخاع العظام الثقافة في GM-CSF، وتحديد السنخية مثل بلعمالسكان من البلدان النامية غير الناضجة والناضجة في ثقافة نخاع العظام عن طريق التدفق الخلوي باستخدام FL-HA ملزمة والتعبير MHCII. ويستند هذا الإجراء على الإجراء المعمول بها لوتز وآخرون (6) وغير قادرة على توليد 5 – 10 × 10 6 خلايا غير ملتصقة في يوم 7 من ثقافة 10 مل. الثقافة هي قابلة للاستخدام من أيام 7-10 وينتج مجموعة متغايرة من الضامة، البلدان النامية غير الناضجة والناضجة، وكذلك بعض الأسلاف في يوم 7. وهذا يوفر طريقة بسيطة لزراعة وعزل في المختبر الضامة السنخية مثل بكميات كبيرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة، ونحن نقدم طريقة لتوليد الضامة والبلدان النامية GM-CSF المستمدة من ثقافة نخاع العظام بالنسبة للفئران واحدة أن يتم تكييف من لوتز وآخرون. 6. MHCII التعبير وFL-HA يميز بين البلدان النامية غير ناضجة والضامة ملزم في هذه الثقافة (انظر الشكل 3C)، ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) (MOP-جرانت 119503) والعلوم والهندسة مجلس الطبيعية في كندا (NSERC). NSERC كما دعمت دراسية الصيف ليارد ومعتمد من AA YD من جامعة كولومبيا البريطانية (UBC) مع منح زمالة لمدة 4 سنوات، ويدعم AA من قبل CIHR مع جائزة طالب دراسات عليا ماجستير (كلية الدراسات العليا-M). نشكر كالفين Roskelley للحصول على المساعدة مع الاداة المستخدمة لتوليد الصور في الشكل (2). نحن نعترف أيضا بدعم من جامعة كولومبيا البريطانية الحيوان والتدفق الخلوي المرافق.
Materials
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Richert | 1490 | |
| Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis–complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a ‘phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: ‘Exhausted’ or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
