Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus
Summary
Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
Abstract
Makrophagen und dendritischen Zellen (DCs) sind angeborene Immun in Geweben und lymphatischen Organen gefunden Zellen, die eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern spielen. Sie sind jedoch schwierig in ausreichender Zahl zu isolieren , sie im Detail zu studieren, also in vitro – Modelle entwickelt wurden. In vitro – Kulturen von Knochenmark stammenden Makrophagen und dendritische Zellen sind gut etabliert und wertvolle Methoden zum immunologischen Studien. Hier wird ein Verfahren zur Kultivierung und beide DCs und Makrophagen aus einer einzigen Kultur primärer Maus-Knochenmarkszellen zu identifizieren mit der Cytokin Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) beschrieben. Dieses Protokoll basiert auf dem etablierten Verfahren zuerst von Lutz et al entwickelt. im Jahr 1999 für die Knochenmark abgeleiteten DCs. Die Kultur ist heterogen, und MHCII und fluoresceinierten Hyaluron (FL-HA) verwendet Makrophagen von unreifen und reifen DCs zu unterscheiden. Diese GM-CSF Makrophagen provide eine bequeme Quelle für in – vitro – Makrophagen , die eng Alveolarmakrophagen in beiden Phänotyp und Funktion ähneln.
Introduction
Mehrere in vitro Kulturverfahren beschrieben wurden Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) und Knochenmark stammenden DCs (BMDCs) unter Verwendung eines oder einer Kombination von Wachstumsfaktoren zu erzeugen. BMDMs kann durch Züchten Knochenmarkszellen erzeugt werden unter Verwendung von entweder Makrophagen – Kolonie – stimulierender Faktor (M-CSF) oder GM-CSF 1,2. Für BMDCs gibt die Zugabe von FLT3 – Ligand an der Knochenmarkkultur zu nicht-haft klassischen und plasmazytoiden DCs (CD11c hoch / MHCII hoch und CD11c lo, B220 + beziehungsweise) nach 9 Tagen in Kultur 3,4. Im Gegensatz dazu nicht adhärenten nach 7 bis 10 Tagen in Kultur erzeugt Zellen mit GM-CSF allein 5,6, GM-CSF und IL-4 7 oder GM-CSF und FLT3 – Ligand 8,9 erzeugen BMDCs mehr ähnelt entzündliche DCs (CD11c hoch, MHCII hohe CD11b +) 10. Obwohl diese in vitro Kulturen werden verwendet , Makrophagen zu erzeugen oderDCs, es ist unklar, ob jede Kultur Anlass zu reinen Populationen gibt. Obwohl beispielsweise adhärente Zellen in den GM-CSF – Kulturen beschrieben Makrophagen 5, die nicht-adhärenten Zellen aus der gleichen Kultur zu sein als DCs 6,11-13, mit der Annahme verwendet , dass sie homogen und jede beobachtete Variabilität sind, aufgrund unterschiedlicher Entwicklungsstadien 14,15. Darüber hinaus haben Studien GM-CSF in vivo gefunden 16,17, ein wesentlicher Wachstumsfaktor für Alveolarmakrophagen Entwicklung zu sein und kann in vitro verwendet werden alveolären Makrophagen-ähnliche 16,17,18 zu erzeugen.
Anders als die Einhaltung sind die Verfahren für Makrophagen und DCs von GM-CSF behandelt Knochenmarkkulturen zu erzeugen sehr ähnliche Heterogenität was darauf hindeutet, innerhalb GM-CSF Knochenmarkkulturen existieren können. Dies scheint auch der Fall zu sein, da zwei Papiere des Vorhandenseins von BMDMs in der nicht-haftenden Fraktion von BMDC Kulturen berichten. In einem Papier, sie identified eine Population von Zellen CD11c +, CD11b +, MHCII mid, MerTK + und CD115 +, der eine Genexpression Signatur ausgedrückt, die am ehesten Alveolarmakrophagen und hatte eine reduzierte Fähigkeit glich zu aktivieren 19 T – Zellen. Das zweite Papier verwendet MHCII und FL-HA eine Alveolarmakrophage artigen Population (CD11c +, MHCII mid / niedrig, FL-HA hoch) zu identifizieren , die von unreifen (CD11c +, MHCII Mitte, FL-HA niedrig) und reifen unterschied DCs (CD11c +, MHCII hoch), die beide phänotypisch und funktionell 18. Diese Papiere zeigen beide, dass GM-CSF BMDC Kulturen heterogen sind, sowohl Makrophagen und DC-Populationen enthalten, die Versorgung angibt, sollten getroffen werden, wenn Daten aus BMDC Kulturen zu interpretieren.
Dieses Protokoll beschreibt, wie Knochenmark, Kultur Knochenmarkzellen in-GM-CSF zu isolieren und zu identifizieren, die Alveolarmakrophage artigenBindung und MHCII Ausdruck Bevölkerung aus den unreifen und reifen DCs im Knochenmarkkultur mittels Durchflusszytometrie FL-HA verwenden. Dieses Verfahren wird auf dem etablierten Verfahren von Lutz et al basierend 6 und 5 in der Lage , zu erzeugen -. 10 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen am Tag 7 einer 10 ml Kultur. Die Kultur ist verwendbar von den Tagen 7 bis 10 und ergibt eine heterogene Population von Makrophagen, unreifen und reifen DCs, sowie einige Progenitoren am Tag 7. Dies stellt eine einfache Methode zu wachsen und in vitro alveolären Makrophagen-ähnliche in großen Mengen zu isolieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Manuskript, stellen wir ein Verfahren zur Erzeugung von GM-CSF Makrophagen und DCs aus einem einzigen Maus – Knochenmarkkultur , die von Lutz angepasst ist , et al. 6. MHCII Expression und FL-HA unterscheidet zwischen unreifen DCs und Makrophagen in dieser Kultur – Bindung (siehe 3C), die bisher schwierig war. Dies, zusammen mit einem anderen Bericht von Helft et al. 19 zeigt die Heterogenität innerhalb GM-CSF induzierten BMDC Kulturen , die bisher ange…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) (Zuschuss MOP-119503) und der Naturwissenschaften und Engineering Council of Canada (NSERC) gefördert. NSERC unterstützt Sommer studentships auch YD und AA YD wird von der University of British Columbia (UBC) mit einem 4-Jahres-Stipendium Auszeichnung unterstützt, AA durch CIHR mit ein Student Master-Auszeichnung (CGS-M) unterstützt. Wir danken Calvin Roskelley für die Unterstützung mit dem Mikroskop die Bilder in Abbildung 2 zu erzeugen , verwendet. Wir erkennen auch die Unterstützung der UBC Tier- und Durchflusszytometrie Einrichtungen.
Materials
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Richert | 1490 | |
| Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
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