Генерация и идентификация GM-CSF производный альвеол, как макрофаги и дендритные клетки из костного мозга мыши
Summary
Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
Abstract
Макрофаги и дендритные клетки (ДК) являются врожденные иммунные клетки, которые находятся в тканях и органах лимфоидных, которые играют ключевую роль в защите от патогенных микроорганизмов. Тем не менее, их трудно выделить в достаточном количестве , чтобы изучить их подробно, поэтому, модели в пробирке, были разработаны. В пробирке культуры из костного мозга макрофаги и дендритные клетки являются хорошо зарекомендовавшие и ценные методы иммунологических исследований. Здесь описан способ культивирования и идентификации как ДТС и макрофаги от одной культуры клеток костного мозга первичной кости мыши с использованием колониестимулирующий фактор макрофагов гранулоцитов цитокина (GM-CSF) описывается. Этот протокол основан на установленном порядке первой разработанной Лутц и др. в 1999 году из костного мозга РС. Культура неоднородна, и MHCII и fluoresceinated гиалуронана (FL-HA) используются для различения макрофаги от незрелых и зрелых ДК. Эти GM-CSF, полученный макрофаги просмотри удобный источник в пробирке полученных макрофагов , которые близко напоминают альвеолярные макрофаги в обоих фенотипа и функции.
Introduction
Существует несколько методов культурах клеток, были описаны для генерации из костного мозга макрофаги (BMDMs) и из костного мозга (DCS BMDCs) с использованием одного или комбинации факторов роста. BMDMs могут быть получены путем культивирования клеток костного мозга с использованием либо макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) или GM-CSF 1,2. Для BMDCs, добавление лиганда FLT3 к культуре костного мозга приводит к неприлипающими классических и плазмоцитов ГЦ (CD11c высокий / MHCII высокий и CD11c Lo, B220 + соответственно) через 9 дней в культуре 3,4. В отличие от этого , не прилипшие клетки генерироваться после 7 до 10 дней в культуре с использованием только GM-CSF 5,6, GM-CSF , и IL-4 , 7, или GM-CSF , и FLT3 лиганд 8,9 генерировать BMDCs более близко напоминающих воспалительные DCs (CD11c высокий, высокий MHCII CD11b +) 10. В то время как эти культуры в пробирке используются для создания макрофаги илиКонтроллеры домена, неясно, если каждая культура порождает чистых популяций. Например, хотя прилипшие клетки в GM-CSF культур описаны как макрофаги 5, неадгезивные клетки из той же самой культуры используются в качестве контроллеров домена 6,11-13, с предположения , что они являются однородными и любых наблюдаемых изменчивость из – за различных этапах развития 14,15. Кроме того, исследования показали , GM-CSF , чтобы стать существенным фактором роста для развития альвеолярных макрофагов в естественных условиях 16,17, и может быть использовано в пробирке для генерации альвеолярных типа макрофаги 16,17,18.
Кроме соблюдения, процедуры генерации макрофаги и контроллеры домена с GM-CSF, обработанных культурах костного мозга очень похожи предполагает гетерогенность может существовать в GM-CSF культурах костного мозга. Это на самом деле, кажется, так, как две газеты сообщают о присутствии BMDMs в неприлипающими фракции BMDC культур. В одном документе, они Опознавательнаяред популяция клеток как CD11c +, CD11b +, MHCII середине, MerTK + и CD115 +, выразившего экспрессии генов подписи , который наиболее близко напоминающее альвеолярные макрофаги и имели пониженную способность активировать Т – клетки 19. Второй документ используется MHCII и FL-HA для идентификации альвеолярного макрофага типа населения (CD11c +, MHCII средний / низкий, FL-HA высокий) , который был отличен от незрелых (CD11c +, MHCII середина, FL-HA низкий) и пожилые РС (CD11c +, MHCII высокий), как фенотипически и функционально 18. Эти документы показывают, что оба GM-CSF BMDC культуры являются гетерогенными, содержащие как макрофаги и популяции DC, указывающего, что следует проявлять осторожность при интерпретации данных из BMDC культур.
Этот протокол описывает, как изолировать костный мозг, клетки мозга кости в культуре GM-CSF, а также определить альвеолярного микрофагоподобныхнаселение от незрелых и зрелых ДК в культуре костного мозга с помощью проточной цитометрии с использованием связывания и экспрессию MHCII FL-HA. Эта процедура основана на установленном порядке Лутц и др 6 и способен генерировать . 5 – 10 х 10 6 неприкрепленных клеток на 7 -й день в 10 мл культуры. Культура может использоваться от 7 дней до 10 и дает гетерогенную популяцию макрофагов, незрелых и зрелых ДК, а также некоторых клеток – предшественников на 7. Это обеспечивает простой способ , чтобы расти и изолировать в пробирке альвеолярно-как макрофаги в больших количествах день.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи, мы предлагаем способ генерирования GM-CSF , полученных макрофаги и контроллеры домена от одной мыши костного мозга культуры , который заимствован из Лутц и др. 6. Выражение MHCII и FL-HA связывание между незрелых отличает ДК и макрофагов в этой культуре (см Рисуно?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) (грант СС-119503) и наук и инженерного совета природного Канады (NSERC). NSERC также поддерживает летние studentships с Ю.Д. и А. А. Ю.Д. поддерживается в Университете Британской Колумбии (UBC) с присуждением стипендий 4 года, AA поддерживается CIHR с присуждением аспирантом магистра (РКУ-М). Мы благодарим Кельвин Roskelley за помощью микроскопа , используемого для формирования изображения на рисунке 2. Мы также отмечаем поддержку со стороны UBC животных и проточной цитометрии сооружений.
Materials
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Richert | 1490 | |
| Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis–complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a ‘phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: ‘Exhausted’ or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
