Vi beskriver en robust gen ersättningsstrategi för att genetiskt manipulera smut svampen Ustilago maydis. Detta protokoll beskriver hur man skapar deletionsmutanter att undersöka infektion fenotyper. Den kan förlängas för att modifiera gener på något önskat sätt, t ex, genom att lägga till en sekvens som kodar för ett fluorescerande protein tagg.
Gendeletion spelar en viktig roll i analysen av genfunktion. En av de mest effektiva metoder för att störa gener i ett målinriktat sätt är utbyte av hela genen med en selekterbar markör via homolog rekombination. Under homolog rekombination sker utbyte av DNA mellan sekvenser med hög likhet. Därför kan linjära genomiska sekvenser som flankerar en målgen användas för att specifikt rikta en selekterbar markör till den önskade integrationsstället. Trubbiga ändar deletionskonstruktionen aktiverar cellens DNA-reparationssystem och därigenom främja integrationen av konstruktionen antingen via homolog rekombination eller genom icke-homolog-end-medlemskap. I organismer med effektiv homolog rekombination, kan hastigheten för framgångsrik gendeletion uppgå till mer än 50% vilket gör denna strategi ett värdefullt genavbrott system. Den smuts svampen Ustilago maydis är en eukaryot modell mikroorganism som visar sådan effektiv homolog recombinatJon. Av dess cirka 6900 gener, många har funktionellt karakteriseras med hjälp av deletionsmutanter och upprepad underlåtenhet av genen ersättningsförsök pekar på grundläggande funktion av genen. Efterföljande karakterisering av genfunktion genom att märka med fluorescerande markörer eller mutationer av förväntade domäner bygger också på DNA-utbyte via homolog rekombination. Här presenterar vi U. maydis stam generation strategi i detalj med hjälp av det enklaste exemplet, den gendeletion.
Ustilago maydis är en fytopatogena modell svamp som har studerats ingående i årtionden 1,2. Den finns i två morfologier, en jäst-liknande, icke-patogena scen och en fintrådiga, smittsam blankett 3. Universella genombrotts upptäckter såsom homolog rekombination och DNA-reparationsmekanismer gjordes i den jästliknande tillväxten skede av denna svamp 4. Dessutom är den morfologiska övergång till infektions glödlampor och virulensfaktorer viktiga för infektion väl karakteriserad 5,6. Den ökande molekyl kunskap om biologi och virulens denna smut svamp bygger på en enkel gen ersättningsstrategi 7-9 stöds av en utmärkt genom anteckning 10 och enkel omvänd genetik att använda, till exempel, den välorganiserade plasmid samling på vårt institut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardiserade, snabba infektionsanalyser i majs seedlings tillåta detaljerade studier av patogenicitet faktorer 11.
Genomet hos U. maydis innehåller cirka 6900 gener 10. Att studera deras funktion, kan de tas bort individuellt eller i kombination på grund av att en effektiv homolog rekombination system. Flankerande regioner av ca 1 kb innehållande perfekt homologa ändar är idealiska för hastigheter av homolog rekombination som är större än 50%, men redan 250 bp med icke-homologa ändarna tillåter en viss grad av korrekt integrering av konstruktionen 9. För närvarande fem olika motstånds kassetter, hygR, cbxR, natR, G418 ^ och phleoR medla motstånd mot hygromycin, karboxin, nourseothricin, G418 och fleomycin, används för att selektera för transformanter 7,9. Dessutom har hygromycinresistens utvecklats till en återvinnings kassett (FRT-hygR) som kan avlägsnas genom övergående uttryck av en heterolog FLP rekombinas 12. Detta möjliggör avlägsnande av motstånd kassett och därmed i teorin obegränsat genetiska modifieringar. Fleomycin är mutagent 13, så att med de nya kassetterna, i synnerhet återvinningsbart hygR kassetten, användning av phleoR minskar. Fyrdubbla mutanter kan således genereras genom användning av de andra fyra kassetter, men för quintuple mutanter, är FRT-hygR rekommenderas en 14.
Denna allmänna strategi gendeletion har överförts till andra smuts svampar såsom Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, eller U. esculenta 17 och därmed ger möjlighet till ytterligare applikationer i ännu genetiskt svår organismer med en effektiv homolog rekombination systemet. Dessutom kan organismer som saknar homolog rekombination vara modifierad för att förbättra genteknik såsom exemplifieras av deletionen av gener som är involverade i icke-homolog-end-gå med i Neurospora crassa 18,19.
Här beskriver vi den publicerade gendeletion strategi för U. maydis 7,9 i experimentell detalj med fokus på snabb och noggrann kontroll av kandidaterna. Som ett exempel använder vi svamp kitinaser och skildrar generering av enstaka mutanter liksom flera radering stammar 20,21. Kitinaser är intressanta exempel, eftersom de agerar på kitin i den styva cellväggen. Cellväggen ombyggnad krävs för morfologiska förändringar under celldelning, byta till fintrådiga tillväxt och sporbildning. Således, för deletionsmutanter fenotyper i hela livscykeln kan förväntas.
Detta protokoll beskriver hur man skapar deletionsmutanter för omvända genetiska studier i U. maydis. Utgångspunkten är en deletion konstruktion som innehåller flankerande sekvenser av genen av intresse som innehåller sekvenser av ca 1 kb uppströms om starten och nedströms om stopp-kodonet samt ett lämpligt motstånd kassett som det var tidigare optimerad 7,9 . Konstruktionerna måste vara individuellt genereras för varje gen och noggrant kontrolleras för sekvens fel innan du tar bort gene…
The authors have nothing to disclose.
Ett särskilt tack till Dr. Benedikt Steuten för kritisk läsning av manuskriptet. Det ursprungliga arbetet på kitinaser utfördes av Dr. Thorsten Langner. Laboratorium VG stöds av Cluster of Excellence i Plant Sciences (CEPLAS, DFG EXC 1028) och BioSC är laboratorium KS stöds av BioSC. KB stöds av BioSC. De vetenskapliga verksamhet Bioekonomi Science Center (BioSC) fick ekonomiskt stöd från ministeriet för innovation, vetenskap och forskning inom ramen för NRW Strategieprojekt BioSC (nr 313 / 323-400-00213). LF stöds av en doktorandtjänst i DFG International Research Training Group 1525 iGRADplant.
Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
Bacto Agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
Bacto Peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
Casamino acids | BD | 223050 | |
Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
Nicotinic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
Pyridoxin (Monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
Thiamin-Hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio | ||
YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |