وصف ملحقات غشاء الخلية ودراسة أدوارهم في ديناميات التصاق خلايا السرطان
Summary
وتوضح هذه الدراسة فائدة وسهولة قياس تمديد الكمية غشاء الخلية وارتباطها بقدرة التصاق الخلايا. وكمثال ممثل، نعرض هنا أن البروتين المتصلة ديككوبف 3 (DKK3) ويشجع تشكيل لوبوبوديا زيادة وخلية أدهيسيفينيس في سرطان البطاني الخلايا في المختبر.
Abstract
مرجع ملحق غشاء الخلية ينظم مختلف السلوكيات الخبيثة خلايا السرطان، بما في ذلك قدراتها لاصقة والمهاجرة. القدرة على دقة تصنيف وتحديد ملحقات الخلية وقياس الأثر على قدرة لاصقة في خلية أمر حاسم لتحديد كيف الخلية مما يشير إلى أحداث تأثير سرطان الخلية السلوك والعدوانية. وهنا يصف لنا في المختبر تصميم واستخدام الخلية الكمي أسلوب التوسيع بالاقتران مع مقايسة قدرة التصاق في نموذج المنشأة في المختبر لسرطان البطاني (لجنة التنسيق الإدارية). على وجه التحديد، نقوم باختبار آثار DKK3، القامع ورم المفترضة، وعامل المؤيدة تمايز، على النمط الظاهري تمديد غشاء خط الخلية لجنة التنسيق الإدارية، SW 13. أننا نقترح هذه الاختبارات تقديم بسيط نسبيا، ويمكن الاعتماد عليها، والمقاييس بسهولة التفسير لتدابير هذه الخصائص في ظروف تجريبية مختلفة.
Introduction
WNT Dysregulated مما يشير إلى دور حاسم في الأورام الخبيثة البطاني1. الأساليب المستخدمة في هذه الدراسة التحقيق ما إذا كان تكميم أفواه DKK3، منظم سلبية من إشارات WNT، يمثل حدثاً dedifferentiation في قشرة الغدة الكظرية ويعزز تشكيل الورم في السياق التغييرات مرجع الخلية-ملحق. DKK3 هو كاتشين 38 يفرز بروتين سكري مع ببتيد إشارة الطرفي ن وقد أظهرت الدراسات السابقة أن التعبير القسري أدت إلى توقيف دورة الخلية وتثبيط السلوك العدواني الخبيث وعكس الظهارية الوسيطة 2من المرحلة الانتقالية.
السلوك الخبيث لسرطان البطاني (لجنة التنسيق الإدارية)، وغيرها من أنواع السرطان، في جزء منه، وتتأثر قدرة الخلايا السرطانية على الواجهة مع الأسطح المحيطة بها، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية، الذي بدوره يسهل غزو الخلايا السرطانية و 3من الهجرة. يتم شرحها دور ملحقات غشاء الخلية المحددة في تطور السرطان يتزايد في سياقات مختلفة، في المقام الأول عن طريق تشكيل فيلوبوديا. على سبيل المثال، قد وجد overexpression قنوات الكالسيوم من نوع L للحث على تشكيل فيلوبوديا والنهوض بورم الخلايا غزو4. وبالمثل، فاسسين، أكتين ملزمة البروتين الحد الأدنى المعرب عنها في أنسجة طبيعية، أيضا overexpressed في الخلايا السرطانية بالاشتراك مع تشكيل فيلوبوديا5. تشكيل لوبوبوديا تمكن الليفية غير الخبيثة لترحيل نحو فعال من خلال مصفوفة خارج الخلوية، ومع ذلك، فقد ثبت أن الخلايا فيبروساركوما تعتمد على نشاط أية بدلاً من لوبوبوديا لتسهيل الهجرة الخلية و 6من الغزو. وقد أظهرنا ذلك الورم المكثفات، بما في ذلك رأس رابطة مجال الأسرة 1 إيسوفورم (RASSF1A) و DKK3، يمكن أن تعمل لتغيير عناصر سيتوسكيليتال وتشجيع تشكيل لاميليبوديا وحركت خصائص الغازية7،8.
على هذا النحو، من المهم لتوصيف تأثيرات الجينات المشتركة في التسرطن وعلاقتها بغشاء الخلية ملحق التعديلات، على وجه التحديد تقييم تشكيل فيلوبوديا، ولوبوبوديا، ولاميليبوديا تحت ظروف الاختبار. دولة من بين أحدث التقنيات الحالية تشمل استخدام أساليب متطورة على نحو متزايد الفحص المجهري، ووسم الفلورسنت، و/أو خوارزميات الحاسوب المعقدة للحصول على البيانات وتفسيرها. بينما هذه الأساليب توفير أدوات تحليلية جديدة وقوية، تعقيدها يحد من استخدامها على نطاق واسع وقدرة على التكيف في تجارب البيولوجيا الخلية. وعلاوة على ذلك، القياس الكمي الدقيق ومراقبة التغيرات في الخلية ملحق مورفولوجيا لا يقاس عادة9،10. وفي المقابل، نقدم تقنية هنا أن يوضحها بدقة الخلية ملحق التعديلات باستخدام التقنيات المجهرية القياسية وأساليب التكيف مع سهولة في المختبر . هذه الأساليب أيضا تحديد كمية كل نوع خلية التمديد في وقت واحد لكل خلية تحليل وتحديد التغييرات الشاملة في مرجع ملحق غشاء الخلية. ونحن أيضا إظهار كيف يمكن أن تتصل هذه التغييرات على خصائص التصاق الخلية.
على سبيل مثال تجريبية، سوف نستخدم خط خلية التي تم إنشاؤها مسبقاً من 13 SW، عينت SW-DDK3، الذي قد تم transfected ثابت مع بلازميد DKK3/pCMV6-دخول ناقلات ومؤثراً أوفيريكسبريسيس DKK3، عامل التفريق في الغدة الكظرية. SW 13 عدم transfected الخلايا والخلايا SW 13 ستابلي transfected مع متجه فارغة (pCMV6-الإدخال)، عينت SW-الأجسام القريبة من الأرض، كضوابط تجريبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يصف لنا في المختبر كمي أسلوب لوصف ملحقات الخلية بسهولة، وشلالات حفرة قليلة، وإمكانية تكرار نتائج موثوقة يمكن تطبيقها لمختلف ظروف الاختبار. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء فحوصات الالتصاق و/أو حركية بسيطة وقابلة للقياس في نفس الوقت للربط بين الأهمية الوظيفية المحتملة للتغيرات الملاح?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتمول “المؤسسة منحة أوهسي” هذا العمل.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
