Caracterización de extensiones de la membrana de la célula y estudiar sus funciones en la dinámica de adherencia celular cáncer
Summary
Este estudio demuestra la utilidad y la facilidad de la medida de extensión cuantitativa membrana de la célula y su correlación con la capacidad adhesiva de las células. Como un ejemplo, aquí mostramos esa proteína Dickkopf-relacionada 3 (DKK3) promueve la formación mayor lobopodia y adhesividad celular adrenocortical carcinoma de células en vitro.
Abstract
Repertorio de extensión de la membrana celular modula diversos comportamientos malignos de las células cancerosas, incluyendo su potencial adhesivo y migratorias. La capacidad para clasificar y cuantificar extensiones de la célula y medir el efecto sobre la capacidad adhesiva de las células exactamente es fundamental para determinar cómo-señalización celular eventos impacto cáncer célula comportamiento y agresividad. Aquí, describimos el diseño en vitro y el uso de un celular cuantificación método de extensión en conjunto con un análisis de la capacidad de adherencia en un modelo establecido en vitro para carcinoma adrenocortical (ACC). En concreto, ponemos a prueba los efectos de DKK3, un supresor tumoral putativo y un factor de Pro-diferenciación, en el fenotipo de la extensión de la membrana de la línea celular ACC, SW-13. Proponemos estos ensayos para proporcionar relativamente simple, confiable, y métricas fácilmente interpretable para medidas de estas características en diversas condiciones experimentales.
Introduction
Dysregulated WNT de señalización juega un papel crítico en neoplasias adrenocorticales1. Los métodos utilizados en este estudio investigan si silenciamiento de DKK3, un regulador negativo de la señalización de WNT, representa un acto de diferenciación en la corteza suprarrenal y promueve la formación de un tumor en el contexto de los cambios de repertorio de extensión de la célula. DKK3 es un 38 kDa secretada glicoproteína con un péptido de señal N-terminal y estudios anteriores han demostrado que su expresión forzada dio lugar a la detención del ciclo celular, inhibe el comportamiento maligno agresivo e invertida epitelial-mesenquimal transición2.
El comportamiento maligno de carcinoma adrenocortical (ACC) y otros tipos de cáncer es, en parte, influenciada por la capacidad de las células tumorales para interactuar con las superficies circundantes, incluyendo la matriz extracelular, que a su vez facilita la invasión del tumor de la célula y migración3. El papel de extensiones específicas de membrana celular en la progresión del cáncer se está demostrando cada vez más en diversos contextos, principalmente a través de la formación de filopodios. Por ejemplo, la sobreexpresión de los canales de calcio tipo L se ha encontrado para inducir la formación de filopodios y promover tumor células invasión4. Del mismo modo, Fascin, una actina proteína de Unión mínimamente expresada en tejido normal, también es sobreexpresada en células de cáncer en asociación con la formación de filopodios5. Lobopodia formación permite a los fibroblastos no malignos migrar con eficacia a través de la matriz extracelular, sin embargo, se ha demostrado que células de fibrosarcoma dependen de la actividad de la metaloproteinasa reemplaza lobopodia para facilitar la migración celular y invasión de6. Hemos demostrado que el tumor supresores, incluyendo Ras Asociación dominio familia 1 isoforma (RASSF1A) y DKK3, puede funcionar para alterar elementos citoesqueléticos y promover formación lamellipodia y bloquear propiedades invasoras7,8.
Como tal, es fundamental para caracterizar los efectos de los genes implicados en la carcinogénesis y su relación con alteraciones de extensión de la membrana de la célula, específicamente evaluar la formación de filopodios, lobopodia y lamellipodia bajo condiciones de prueba. Técnicas de vanguardia actuales incluyen el uso de métodos cada vez más sofisticados de la microscopia, etiquetado fluorescente o complejos algoritmos para adquisición de datos y la interpretación. Mientras que estos métodos proporcionan nuevas y poderosas herramientas analíticas, su complejidad limita su uso generalizado y la adaptabilidad en los experimentos de biología celular. Además, la cuantificación precisa y la observación de cambios en la morfología de la extensión de la célula no es normalmente medido9,10. Por el contrario, presentamos aquí una técnica que cuantifica con precisión alteraciones de la extensión de la célula usando técnicas microscópicas estándar y fácilmente adaptable en vitro métodos. Estos métodos también cuantificar cada tipo de extensión de la célula simultáneamente para cada célula analizada y determinan los cambios generales en el repertorio de extensión de la membrana de la célula. Mostramos también cómo estos cambios pueden se relacionan con propiedades de adherencia de la célula.
Experimental por ejemplo, usamos una línea celular creado anteriormente de SW-13, señalado SW-DDK3, que ha sido estable transfected con los vectores del plasmid de entrada/pCMV6-DKK3 y constitutivamente overexpresses DKK3, un elemento diferenciador en la glándula suprarrenal. Células SW-13 no transfectadas y SW-13 estable transfectadas con el vector vacío (entrada pCMV6), designado SW-Neo, servirá como controles experimentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un método cuantitativo en vitro para caracterizar extensiones de la célula con facilidad, algunas caídas de hoyo y reproducibilidad confiable que puede ser aplicado para diferentes condiciones de prueba. Por otra parte, ensayos de adhesión y motilidad simple, cuantificables pueden realizarse simultáneamente para correlacionar el potencial significación funcional de las alteraciones observadas en las extensiones de la membrana de la célula.
Sin embargo, estos m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Fundación de la beca de Ohse financiado este trabajo.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
