Характеристика расширений клеточной мембраны и изучения их роли в динамике адгезии клеток рака
Summary
Это исследование свидетельствует о полезности и простота расширения измерение количественных клеточной мембраны и его корреляция клей способности клеток. Как пример мы показываем здесь что связанных с Dickkopf белком 3 (DKK3) способствует формированию более lobopodia и адгезии клеток в Адренокортикальной рак клеток в пробирке.
Abstract
Расширение репертуара клеточной мембраны модулирует различных злокачественных поведение раковых клеток, включая их клей и мигрирующих потенциалов. Способность точно классифицировать и подсчитать ячейки расширений и измерить эффект на клетки клей потенциала имеет решающее значение для определения как клетки сигнализации поведение клеток рака влияние события и агрессивность. Здесь мы описываем в vitro разработки и использования клеток количественного определения метода расширения в сочетании с assay способности адгезии в установленных в vitro модели для адренокортикальной карциномы (АКК). В частности мы тестируем воздействия DKK3, подавитель предполагаемого опухоли и про дифференциация фактором, на фенотип расширение мембраны клеточной линии АКК, SW-13. Мы предлагаем эти анализы предоставлять относительно простые, надежные и легко интерпретировать данные метрик для мер эти характеристики в различных экспериментальных условиях.
Introduction
Dysregulated WNT сигнализации играет важную роль в адренокортикальной злокачественных1. Методы, используемые в данном исследовании расследовать ли глушителей из DKK3, негативный регулятор WNT сигнализации, представляет собой событие дифференцировке в коры надпочечников и способствует формированию опухоли в контексте изменения клеток расширение репертуара. DKK3 — 38 кДа выделяется гликопротеин с пептидной сигнал N-стержня и предыдущие исследования показали его насильственного выражение привели к аресту клеточного цикла, тормозится агрессивное поведение злокачественных и вспять эпителия мезенхимальных 2переход.
Злокачественные поведение адренокортикальной карциномы (АКК) и другие виды рака, в части, под влиянием опухолевых клеток способность взаимодействовать с окружающих поверхностей, включая внеклеточного матрикса, который в свою очередь облегчает вторжение клеток опухоли и миграции3. Время роль конкретных клеточной мембраны расширений в прогрессии рака чаще проявляется в различных контекстах, главным образом через формирование filopodia. Например чтобы побудить filopodia формирования и поощрения опухолевых клеток вторжения4было установлено гиперэкспрессия L-типа кальциевых каналов. Аналогично Башчаршия, актина, связывая протеин минимально выраженные в нормальной ткани, также гиперэкспрессия в раковых клетках в ассоциации с filopodia формирования5. Lobopodia формирования позволяет незлокачественных фибробластов эффективно перенести через внеклеточных матрицы, однако, было показано, что клетки фибросаркома полагаются на металлопротеиназы деятельности вместо lobopodia для облегчения миграции клеток и вторжения6. Мы показали, что опухолевые супрессоры, включая рас Ассоциация домена семьи 1 изоформы (RASSF1A) и DKK3, может работать для изменения цитоскелета элементов и поощрения формирования lamellipodia и загнать в угол инвазивные свойства7,8.
Таким образом важно, чтобы характеризовать эффекты генов, участвующих в канцерогенеза и их отношения к клеточной мембраны расширение изменения, в частности оценки формирования filopodia, lobopodia и lamellipodia в условиях испытания. Текущее состояние оф-арт методы включают в себя использование микроскопии все более изощренные методы, люминесцентные маркировки и/или сложных компьютерных алгоритмов для сбора данных и интерпретации. Хотя эти методы предоставляют новые и мощные аналитические инструменты, их сложность ограничивает их широкого использования и адаптации в биологии клеток экспериментов. Кроме того точную количественную оценку и наблюдение изменений в морфологии клеток расширение не является обычно измеренных9,10. Напротив мы представляем технику, которая точно количественно изменения расширения клеток с помощью стандартных микроскопические и легко могут быть приспособлены в vitro методов. Эти методы также количественную оценку каждой ячейки тип расширения одновременно для каждой ячейки проанализированы и определить общие изменения в репертуаре расширение клеточной мембраны. Мы также показать, как эти изменения могут относиться к адгезионные свойства ячейки.
В качестве примера экспериментальный мы будем использовать ранее созданные ячейки линия SW-13 места для SW-DDK3, которая была стабильно transfected с pCMV6-вход/DKK3 плазмиды векторов и конститутивно overexpresses DKK3, дифференцирующим фактором в надпочечников. Non-transfected SW-13 клетки и клетки SW-13, стабильно transfected с пустой вектор (pCMV6-вход), Места для SW-нео, будет служить экспериментальных элементов управления.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем в vitro количественный метод для характеристики клеток расширения с легкостью, несколько Пит Фолс и надежный воспроизводимости результатов, которые могут применяться для различных условий теста. Кроме того простой, количественно адгезии и/или подвижности анализ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ОГСЕ Грант фонда финансирование этой работы.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
