Visuele detectie van meerdere Nucleic Acids in een capillaire matrix
Summary
Dit protocol beschrijft de fabricage van een kleine, kant-en-klare cassette die kan worden toegepast voor visuele detectie van meerdere nucleic zuren in een enkele, test die is eenvoudig te bedienen. In deze benadering werd een capillaire matrix gebruikt voor multiplex en zeer efficiënte opsporing van GGO-doelstellingen.
Abstract
Voor meerdere doelen, korte tijd en resource-betaalbare methoden voor de detectie van meerdere nucleic zuren in één, eenvoudig te bedienen test zijn dringend nodig in de diagnose van de ziekte, microbiële monitoring, detectie van genetisch gemodificeerd organisme (GGO), en forensische analyse. Wij hebben eerder het platform genaamd rust (Capillary Array gebaseerde Loop-gemedieerde isotherme amplificatie voor Multiplex visuele detectie van nucleïnezuren) beschreven. Hierin beschrijven we verbeterde fabricage en prestaties processen voor dit platform. Hier, hanteren wij een kleine, kant-en-klare cassette gemonteerd door capillaire matrix voor multiplex visuele detectie van nucleïnezuren. De capillaire array is vooraf behandeld in een hydrofobe en hydrofiele patroon voordat tot vaststelling van de lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) primer sets in de haarvaten. Na montage van de laden-adapter, wordt de LAMP reactiemengsel geladen en geïsoleerd in elke capillair, als gevolg van de capillaire werking door een pipetting Macrostap. De reacties van de LAMP worden uitgevoerd in parallel in de haarvaten. De resultaten zijn visueel voorgelezen door verlichting met een handbediende UV-zaklamp. Met behulp van dit platform, tonen wij monitoring van 8 verschijnen vaak elementen en genen in GGO monsters met hoge specificiteit en de gevoeligheid. Kortom, is de hierin beschreven platform bedoeld om de detectie van meerdere nucleïnezuren. Wij zijn van mening dat zal zij breed toepasbaar is in velden waar high-throughput nucleïnezuur analyse vereist is.
Introduction
Goedkope, snelle en makkelijk te gebruiken systemen voor de simultane detectie van meerdere nucleïnezuren zijn dringend nodig in een breed scala van terreinen, zoals klinische diagnostiek1,2,3, GGO detectie4, 5,6, microbiële toezicht7,8,9, forensische analyse10,11, en met name point-of-care tests (POCTs), waar middelen zijn meestal beperkt12,13,14.
Polymerase-kettingreactie (PCR), met inbegrip van de methoden van ervan afgeleide PCR in real time en multiplex PCR, is de meest toegepaste techniek voor de detectie in deze velden. Echter, deze methoden meestal slechts één doel ontdekken in één test15 en zij vereisen elektriciteit en geavanceerde professionele apparatuur.
Een andere veelbelovende technologie voor het opsporen van nucleïnezuren is lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP), die voor het eerst in 200016 beschreven werd. LAMP is een hoog rendement DNA detectiemethode. Theoretisch, kan het versterken vanaf 1 exemplaar naar 109 exemplaren van waarbij binnen een uur, alle uitgevoerd bij een constante temperatuur, (dat wil zeggen, tussen 60-65 ° C). Succesvolle versterking zal produceren een grote hoeveelheid de onoplosbare bijproduct pyrofosfaat en veroorzaken een verandering in de troebelheid17, die niet rechtstreeks met het blote oog kan worden waargenomen. Een kleurverandering kan ook worden waargenomen door de toevoeging van metaalionen of fluorescente kleurstoffen zoals calceïne18nucleïnezuur kleurstof19en hydroxyl naftol blauw20. Vanwege de voordelen van hoge gevoeligheid en gemak van verrichting, wordt LAMP algemeen toegepast in nucleïnezuur-detectie.
Momenteel zijn er hoofdzakelijk twee strategieën voor multiplex LAMP testen. Een is voor het uitvoeren van meerdere LAMP testen door het hebben van meerdere LAMP primer ingesteld in één buis21,22,23. Echter zou de veelheid en de versterking-efficiëntie worden beperkt door de intrinsieke inmenging en de concurrentie tussen verschillende primer sets. Bovendien kan het lastig zijn te achterhalen van de verschillende producten van de LAMP in de zelfde reactie. Een andere strategie is gebaseerd op fysieke isolement. Verschillende primer sets werden geïsoleerd in individuele verkleinde compartimenten en meerdere LAMP reacties worden vervolgens uitgevoerd gelijktijdig24,25. Deze benaderingen, die over het algemeen zijn gebaseerd op microfluidic chips, bieden een mogelijke oplossing voor high-throughput LAMP reacties. Echter, de vervaardiging van de chips en de multiplex pre coating van primer verzamelingen is gecompliceerd, die kan leiden tot hogere kosten en verminderen van de reproduceerbaarheid.
Onlangs hebben een paar studies beschreven presterende LAMP reacties in haarvaten te omzeilen de ingewikkelde fabricage van microfluidic chips en goedkope detectie26,27hebben bereikt. Echter met betrekking tot de analyse van de high-throughput lijken deze haarvaten op miniatuur versies van PCR strip buizen, omdat de monsters en reactie reagentia (met inbegrip van de verschillende primer-sets) worden afzonderlijk bereid en geleverd aan verschillende reactie-eenheden binnen de haarvaten. Om te bereiken parallelle en multiplex analyse, is extra apparatuur, bijvoorbeeld een meerkanaals-spuitpomp, vereist voor de parallelle laden van monsters of reagentia.
Om te overwinnen van de beperkingen die zijn gekoppeld aan de huidige methoden voor multiplex detectie van nucleïnezuren, hebben we een verkleinde platform dat visuele LAMP-technologie met een capillaire matrix combineert ontwikkeld. Dit platform is voor meerdere doelen, compacte, lage kosten, en eenvoudig te bedienen van28. Hierin beschrijven we de details van hoe te fabriceren van de capillaire matrix en het uitvoeren van de reacties van de LAMP in de matrix. Het protocol hier beschreven is gestandaardiseerd gebruik van genetisch gemodificeerd organisme (GGO) detectie als een model. Nog belangrijker is, kan dit protocol ook worden gebruikt in high-throughput detectie van andere doelstellingen van de nucleïnezuur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het kalme platform hier gedemonstreerd, die de LAMP-technologie combineert met een capillaire array, laat de simultane detectie van meerdere gene GGO-gerelateerde doelen in een enkele, zeer effectieve en gemakkelijk te bedienen test.
Voor het succesvol uitvoeren de multiplex LAMP reacties in de cassette, moet drie kritieke punten om opgemerkt te worden. Ten eerste het bereiken van dezelfde hoogte voor de bovenzijde van de haarvaten en de hydrofiele en hydrofobe patroon van de capillaire matrix…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door nationale Natural Science Foundation van China subsidies (31370813, 3147670, 31670831 en 31600672,), de nationale transgene Plant speciaal fonds (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), het programma voor de nieuwe eeuw uitstekende talenten in Universiteit, de nationale belangrijkste onderzoeks- en ontwikkelingsproject van China (2016YFA0500601) en China postdoctorale Science Foundation (2016M 591667).
Materials
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
- Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
- Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
- Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
- Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how?. J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
- Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
- Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
- Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
- Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
- Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
- Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
- Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
- Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
- Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
- Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
- Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
- Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
- Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
- Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
- Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).
