זיהוי ויזואלי של מספר חומצות גרעין ב מערך נימי
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של קלטת קטן, מוכן לשימוש, שניתן להחיל לצורך זיהוי חזותי של מספר חומצות גרעין בבדיקה אחת, קלה לתפעול. בגישה זו, מערך נימי שימש לצורך זיהוי מולטיפלקס ויעיל מאוד של GMO מטרות.
Abstract
מטרות מרובות, זמן קצר, ומתודולוגיות משאבים-סבירים עבור הגילוי של מספר חומצות גרעין יחיד, קלה לתפעול הבדיקה נדרשים בדחיפות אבחון מחלת, ניטור מיקרוביאלי, זיהוי אורגניזם מהונדס גנטית (GMO), ו בדיקת מז פ. בעבר תארנו פלטפורמת שנקרא שלווה (Capillary Aמבוססי rray Lבתיווך oop איזותרמי הגברה לצורך זיהוי חזותי של ultiplex מ’של חומצות גרעין). במסמך זה, אנו מתארים משופרת ייצור ותהליכים ביצועים עבור הפלטפורמה. כאן, אנו מיישמים קלטת קטנה, מוכן לשימוש נאספו על ידי מערך נימי לזיהוי חזותי מולטיפלקס של חומצות גרעין. המערך נימי הוא התייחס מראש לתוך תבנית הידרופוביות, הידרופילית לפני תיקון בתיווך לופ הגברה איזותרמי (מנורה) פריימר קבוצות נימים. לאחר הרכבה של מתאם טעינה, תערובת התגובה המנורה טעון, מבודד לתוך כל נים, עקב כוח נימי מאת pipetting צעד אחד. התגובות המנורה מתבצעים במקביל הנימים. התוצאות נקראים חזותית על ידי תאורה עם פנס UV ידניים. באמצעות פלטפורמה זו, נדגים ניטור של 8 לעתים קרובות להופיע ורכיבים של גנים בדגימות GMO ירידה לפרטים גבוהה ורגישות. לסיכום, פלטפורמת המתוארים במסמך זה נועד להקל על הזיהוי של מספר חומצות גרעין. אנו מאמינים שיהיה החלים נרחב בתחומים בהם דרושה ניתוח חומצת גרעין תפוקה גבוהה.
Introduction
מערכות בעלות נמוכה, מהירה, קלה לשימוש עבור גילוי בו זמנית של מספר חומצות גרעין נחוצים בדחיפות במגוון רחב של תחומים, כגון אבחון קליני1,2,3, זיהוי GMO4, 5,6, חיידקים ניטור7,8,9, בדיקת מז פ10,11, במיוחד בשלב של טיפול בדיקות (POCTs), שבו משאבים הם בדרך כלל מוגבלת12,13,14.
תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), כולל שיטות נגזרות שלו בזמן אמת PCR ו- PCR מולטיפלקס, היא הטכניקה שימושית נרחב ביותר לגילוי בתחומים אלה. עם זאת, שיטות אלה בדרך כלל לזהות רק מטרה אחת מבחן אחד15 והן דורשות חשמל וציוד מקצועי ומתוחכם.
טכנולוגיה מבטיחה אחרת לגילוי חומצות גרעין הוא בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (מנורה), אשר תוארה לראשונה בשנת 200016. המנורה היא יעילות גבוהה שיטת זיהוי ה-DNA. באופן תיאורטי, זה להגביר את מעותק 1 ל 109 עותקים של amplicons בתוך שעה אחת, כל תרגיל בטמפרטורה קבועה, (דהיינו, בין 60-65 מעלות צלזיוס). הגברה מוצלח לייצר כמות גדולה של רב-תכליתי לוואי לא מסיסים, לגרום לשינוי במצב עכירות17, אשר יכול להיות שנצפו ישירות בעין בלתי מזוינת. שינוי צבע יכול גם להיות שנצפו על ידי התוספת של יונים מתכתיים או צבעי פלורסנט כגון Calcein18, חומצת גרעין לצבוע19הידרוקסיל naphthol כחול20. בגלל היתרונות של רגישות גבוהה ונוחות של המבצע, המנורה מוחל נרחב בזיהוי חומצת גרעין.
כיום, קיימות אסטרטגיות בעיקר שני מבחני המנורה מולטיפלקס. אחת היא לבצע מבחני המנורה מרובים על-ידי המנורה מרובים פריימר מגדיר את שפופרת אחת21,22,23. עם זאת, הריבוי ואת היעילות הגברה מוגבלת על ידי הפרעה פנימית ועל תחרות בין קבוצות שונות פריימר. יתר על כן, זה יכול להיות קשה לזהות מוצרים שונים המנורה אותה התגובה. אסטרטגיה נוספת מבוססת על בידוד פיזי. ערכות פריימר שונים היו מבודדים לתוך תאים בודדים מיניאטורי, וכל מספר תגובות המנורה ואז יבוצעו בו זמנית24,25. גישות אלה, אשר בדרך כלל מבוססים על שבבי microfluidic, מספקים פתרון אפשרי לתגובות המנורה תפוקה גבוהה. אולם, לייצור השבבים ואת הציפוי קדם מולטיפלקס של ערכות פריימר הוא מסובך, אשר עשויים להגדיל את עלויות ולהקטין הפארמצבטית.
לאחרונה, מחקרים אחדים תיארו המנורה ביצוע, בתגובות נימים לעקוף את הזיוף מסובך של שבבי microfluidic, השיגו בעלות נמוכה זיהוי26,27. עם זאת, לגבי ניתוח תפוקה גבוהה, נימים אלה דומים מיניאטורי גירסאות של רצועת המבחנות כי הדגימות ואת התגובה ריאגנטים (כולל ערכות שונות פריימר) חייב להיות בנפרד מוכן להישלח שונים תגובת יחידות בתוך נימים. כדי להשיג במקביל וניתוח מולטיפלקס, ציוד נוסף, לדוגמה משאבת מזרק רב-ערוצי, נדרש לטעינה מקבילים של דוגמאות או נוגדנים.
כדי להתגבר על המגבלות הקשורות השיטות לגילוי מולטיפלקס של חומצות גרעין, פיתחנו פלטפורמה ולמחקר המשלב טכנולוגיה המנורה חזותית עם מערך נימי. פלטפורמה זו היא מטרות מרובות, קומפקטית בגודל, עלות נמוכה, וקל לתפעול28. במסמך זה, אנו מתארים את הפרטים של כיצד לפברק את מערך נימי ולבצע את התגובות המנורה במערך. הפרוטוקול המתואר כאן יש כבר סטנדרטית באמצעות זיהוי אורגניזם מהונדס גנטית (GMO) כמודל. חשוב לציין, פרוטוקול זה יכול לשמש גם בזיהוי תפוקה גבוהה של מטרות חומצות גרעין אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פלטפורמת רגוע המודגמות כאן, אשר משלבת את הטכנולוגיה המנורה עם מערך נימי, מאפשרת זיהוי מטרות מרובות הקשורות GMO גן יחיד, מאוד יעיל וקל לתפעול מבחן בו זמנית.
כדי לבצע בהצלחה את התגובות המנורה מולטיפלקס בקלטת, שלוש נקודות קריטיות צריך להיות לב. ראשית, להשגת באותו גובה בחלק העליון…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה מומן בחלקו על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין מענקים (31370813, 3147670, 31670831, 31600672,), הטרנסגניים צמח מיוחד הקרן (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), תוכנית עבור כשרונות חדשים של מצוינות המאה ב האוניברסיטה הלאומית למחקר מפתח, פרוייקט פיתוח של סין (2016YFA0500601) ו סין-דוקטורט למדע (2016 ז 591667).
Materials
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
- Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
- Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
- Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
- Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how?. J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
- Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
- Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
- Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
- Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
- Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
- Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
- Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
- Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
- Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
- Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
- Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
- Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
- Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
- Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
- Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).
