Detecção visual de vários ácidos nucleicos em uma matriz capilar
Summary
Este protocolo descreve a fabricação de uma gaveta pequena, ready-to-use que pode ser aplicada para a detecção visual de vários ácidos nucleicos em um teste único, que é fácil de operar. Nesta abordagem, uma matriz capilar foi usado para multiplex e altamente eficiente detecção de alvos de OGM.
Abstract
Vários destinos, curto período de tempo e recurso-acessível metodologias para a detecção de vários ácidos nucleicos em um único, fácil de operar o teste são urgentemente necessários no diagnóstico da doença, monitorização microbiana, deteção de organismo geneticamente modificado (OGM), e análise forense. Descrevemos anteriormente a plataforma chamada calma (Capillary Abaseada em rray Loop-mediada isotérmica amplificação para Multiplex de detecção visual de ácidos nucleicos). Aqui, descrevemos melhorada fabricação e processos de desempenho para essa plataforma. Aqui, nós aplicamos uma gaveta pequena, ready-to-use montada por matriz capilar para multiplex de detecção visual de ácidos nucleicos. A matriz capilar é previamente tratada dentro de um padrão hidrofóbico e hidrofílico antes da fixação mediada por loop de amplificação isotérmica (lâmpada) cartilha de moda em capilares. Após a montagem do adaptador de carregamento, mistura de reação de lâmpada é carregada e isolada em cada capilar, devido a força capilar por uma única etapa de pipetagem. As reações de lâmpada são executadas em paralelo em capilares. Os resultados são lidos visualmente para fora pela iluminação com uma lanterna UV à mão. Usando esta plataforma, demonstramos que o monitoramento de 8 frequentemente aparecendo elementos e genes em amostras de OGM com sensibilidade e alta especificidade. Em resumo, a plataforma descrita neste documento destina-se a facilitar a detecção de vários ácidos nucleicos. Acreditamos que será amplamente aplicável em áreas onde a análise de ácidos nucleicos de alto rendimento é necessária.
Introduction
Sistemas de baixo custo, rápidos e fácil de usar para a detecção simultânea de vários ácidos nucleicos são urgentemente necessárias em uma escala larga dos campos, tais como diagnósticos clínicos1,2,3, OGM deteção4, 5,6, microbiana monitoramento7,8,9, análise forense de10,11e testes especialmente point-of-care (POCTs), onde os recursos são geralmente limitadas12,13,14.
Cadeia da polimerase (PCR), incluindo seus métodos derivados do PCR em tempo real e PCR multiplex, é a técnica mais amplamente aplicada para a deteção nestes campos. No entanto, esses métodos tipicamente somente detectam um alvo em um teste de15 e eles exigem electricidade e sofisticados equipamentos profissionais.
Outra tecnologia promissora para a detecção de ácidos nucleicos é mediada por Loop isotérmica amplificação (lâmpada), que foi descrita pela primeira vez em 2000,16. A lâmpada é uma método de deteção de DNA de alta eficiência. Teoricamente, ele pode amplificar de 1 cópia de 10 exemplares9 amplicons dentro de uma hora, tudo realizado a uma temperatura constante, (ou seja, entre 60-65 ° C). Amplificação bem-sucedida irá produzir uma grande quantidade de pirofosfato o subproduto insolúvel e causar uma mudança na turbidez17, que poderia ser diretamente observado a olho nu. Uma mudança de cor também pode ser observada pela adição de íons metálicos ou corantes fluorescentes como calceína18, ácido nucleico tintura19e hidroxila naftol azul20. Por causa da conveniência da operação e as vantagens de alta sensibilidade, lâmpada está sendo amplamente aplicada na deteção de ácido nucleico.
Atualmente, existem principalmente duas estratégias para ensaios de luz multiplex. Um é executar múltiplos ensaios de lâmpada por ter vários lâmpada cartilha define em um tubo21,22,23. No entanto, a multiplicidade e a eficiência de amplificação iria ser limitadas pela interferência intrínseca e competição entre diferentes da primeira demão de moda. Além disso, pode ser difícil identificar os diferente produtos de lâmpada na mesma reação. Outra estratégia baseia-se no isolamento físico. Primeira demão diferentes conjuntos foram isolados em compartimentos individuais de miniaturizado, e várias reações de lâmpada então são executadas simultaneamente24,25. Essas abordagens, que são geralmente baseadas em chips microfluídicos, fornecem uma solução em potencial para reações de lâmpada de alta produtividade. No entanto, a fabricação dos chips e o multiplex pre-revestimento da primeira demão de moda é complicado, que podem aumentar os custos e diminuir a reprodutibilidade.
Recentemente, alguns estudos descreveram realizando reações de lâmpada em capilares para ignorar a complicado fabricação de chips microfluídicos e alcançaram a deteção de baixo custo26,27. No entanto, com relação à análise de alta produtividade, esses capilares são semelhantes às versões em miniatura de tira da polimerase, porque as amostras e os reagentes da reação (incluindo os conjuntos de diferentes da primeira demão) devem ser individualmente preparados e entregues a diferentes unidades de reação dentro de capilares. Para realizar a análise paralela e multiplex, equipamento adicional, por exemplo, uma bomba de seringa multicanal, é necessário para carregamento paralelo de amostras ou reagentes.
Para superar as limitações associadas com os atuais métodos para multiplex detecção de ácidos nucleicos, desenvolvemos uma plataforma miniaturizada que combina tecnologia de iluminação visual com uma matriz capilar. Esta plataforma é para vários destinos, compacto em tamanho, baixo custo e fácil de operar28. Aqui, descrevemos os detalhes de como fabricar a matriz capilar e realizar as reações de lâmpada na matriz. O protocolo descrito aqui tem sido padronizado usando a deteção de organismo geneticamente modificado (OGM) como um modelo. Importante, este protocolo também pode ser usado para detecção de alta produtividade de outros alvos de ácido nucleico.
Protocol
Representative Results
Discussion
A plataforma calma demonstrado aqui, que combina a tecnologia da lâmpada com uma matriz capilar, permite a detecção simultânea de múltiplos alvos de gene OGM-relacionados em um único, altamente eficaz e fácil de operar o teste.
Para executar com êxito as reações de lâmpada multiplex na gaveta, três pontos críticos precisam ser notado. Em primeiro lugar, alcançar a mesma altura para o lado superior dos capilares e o padrão hidrofílico e hidrofóbico da matriz capilar são críti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado em parte por nacional ciência Natural da China subsídios da Fundação (31370813, 3147670, 31670831 e 31600672,), o fundo nacional de transgénicos planta especial (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), programa de novos talentos de excelente do século em Universidade, os nacionais de investigação fundamental e projeto de desenvolvimento da China (2016YFA0500601) e China ciência Postdoctoral Foundation (2016M 591667).
Materials
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
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