Riconoscimento visivo delle più acidi nucleici in una matrice capillare
Summary
Questo protocollo descrive la realizzazione di una cassetta piccola, ready-to-use che possa essere applicata per rilevamento visivo degli acidi nucleici multipli in un singolo, test che è facile da usare. In questo approccio, una matrice capillare è stata utilizzata per il rilevamento di multiplex e altamente efficiente di bersagli di OGM.
Abstract
Multi-target, breve periodo di tempo e risorse-affordable metodologie per la rilevazione degli acidi nucleici multipli in un unico, facile da usare prova sono urgentemente necessari nella diagnosi della malattia, monitoraggio microbico, rilevamento di organismi geneticamente modificati (OGM), e analisi forense. Precedentemente abbiamo descritto la piattaforma chiamata calma (Capillary Abase di rray Loop-amplificazione isotermica mediata da per Multiplex rilevamento visivo degli acidi nucleici). Qui, descriviamo una migliore processi di fabbricazione e le prestazioni per questa piattaforma. Qui, applichiamo una cassetta piccola, ready-to-use, assemblata da matrice capillare per multiplex rilevamento visivo degli acidi nucleici. La matrice capillare è pre-trattata in un modello idrofobico e idrofilico prima set di primer di amplificazione isotermica mediata da loop (lampada) di fissaggio nei capillari. Dopo il montaggio della scheda di caricamento, la miscela di reazione di lampada è caricato e isolato in ogni capillare, a causa della forza capillare con un solo passaggio di pipettaggio. Le reazioni di lampada vengono eseguite in parallelo nei capillari. I risultati sono visivamente leggere di illuminazione con una torcia UV portatile. Utilizzando questa piattaforma, dimostriamo che il monitoraggio di 8 che frequentemente compaiono elementi e geni nei campioni di OGM con sensibilità e alta specificità. In sintesi, la piattaforma descritta nel presente documento è destinata a facilitare la rilevazione degli acidi nucleici più. Crediamo che sarà ampiamente applicabile nei campi dove è richiesta l’analisi di acidi nucleici ad alta velocità.
Introduction
Sistemi di basso costo, veloce e facile da usare per la rilevazione simultanea di più acidi nucleici sono urgentemente necessari in una vasta gamma di settori, quali la diagnostica clinica1,2,3, OGM rilevazione4, 5,6, microbica monitoraggio7,8,9, analisi forense10,11e soprattutto di point-of-care test (POCTs), dove le risorse sono limitati solitamente12,13,14.
Reazione a catena della polimerasi (PCR), compresi i suoi metodi derivati Real-Time PCR e PCR multiplex, è la tecnica più ampiamente applicata per il rilevamento in questi campi. Tuttavia, questi metodi in genere solo rilevare un target in uno prova15 e richiedono elettricità e sofisticate attrezzature professionali.
Un’altra tecnologia promettente per la rilevazione degli acidi nucleici è amplificazione isotermica mediata da Loop (lampada), che è stato descritto nel 200016. LAMPADA è un metodo di rilevazione del DNA di alta efficienza. Teoricamente, può amplificare da 1 copia a 109 copie degli ampliconi entro un’ora, tutte eseguite a temperatura costante, (cioè, tra 60-65 ° C). Amplificazione di successo produrrà una grande quantità di pirofosfato del sottoprodotto insolubile e causa un cambiamento della torbidità17, che potrebbe essere direttamente osservata ad occhio nudo. Un cambiamento di colore può essere osservato anche con l’aggiunta di ioni metallici o coloranti fluorescenti quali18calceina, acido nucleico tintura19e idrossile naftolo blu20. Per i vantaggi di alta sensibilità e la convenienza di funzionamento, lampada viene ampiamente applicato nella rilevazione dell’acido nucleico.
Attualmente, ci sono principalmente due strategie per multiplex lampada saggi. Uno è quello di eseguire le analisi multiple lampada avendo più lampada primer imposta in uno tubo21,22,23. Tuttavia, la molteplicità e l’efficienza di amplificazione sarebbe limitati dalle interferenze intrinseche e dalla concorrenza tra insiemi differenti dell’iniettore. Inoltre, può essere difficile identificare diverse lampada prodotti nella reazione stessa. Un’altra strategia è basata sull’isolamento fisico. Insiemi differenti dell’iniettore sono stati isolati in singoli compartimenti miniaturizzati e reazioni multiple lampada quindi vengono eseguite contemporaneamente24,25. Questi approcci, che sono generalmente basati sul chip microfluidici, forniscono una soluzione potenziale per le reazioni di lampada di alto-rendimento. Tuttavia, la fabbricazione dei chip e il multisala pre-rivestimento di insiemi dell’iniettore è complicato, che può aumentare i costi e diminuire la riproducibilità.
Recentemente, alcuni studi hanno descritto performanti lampada reazioni nei capillari di bypassare la fabbricazione complicata di chip microfluidici e hanno raggiunto il rilevamento di basso costo26,27. Tuttavia, per quanto riguarda l’analisi di alto-rendimento, questi capillari sono simili alle versioni in miniatura di provette per PCR striscia, perché i campioni e reagenti di reazione (compresi gli insiemi differenti dell’iniettore) devono essere individualmente preparati e consegnati a diversi unità di reazione all’interno dei capillari. Per ottenere analisi parallela e multiplex, attrezzature supplementari, ad esempio una pompa a siringa multicanale, sono richiesta per il caricamento parallelo dei campioni o reagenti.
Per superare le limitazioni connesse con i metodi correnti per multiplex rilevazione degli acidi nucleici, abbiamo sviluppato una piattaforma miniaturizzata che combina tecnologia lampada visiva con una matrice capillare. Questa piattaforma è multi-target, compatto nelle dimensioni, basso costo e facile da usare di28. Qui, descriviamo i dettagli di come fabbricare la matrice capillare ed eseguire le reazioni lampada nella matrice. Il protocollo descritto qui è stato standardizzato mediante rilevamento di organismi geneticamente modificati (OGM) come un modello. D’importanza, questo protocollo utilizzabile anche nella rilevazione di alto-rendimento di altri obiettivi di acido nucleico.
Protocol
Representative Results
Discussion
La piattaforma calma dimostrata qui, che combina la tecnologia della lampada con una matrice capillare, permette la rilevazione simultanea di più OGM-relativi geni bersaglio in un unico, altamente efficace e facile da usare prova.
Per eseguire correttamente le reazioni lampada multiplex nel cassetto, tre punti critici devono essere notato. In primo luogo, ottenere la stessa altezza per il lato superiore dei capillari e il modello idrofile e idrofobe della matrice capillare sono critici per ca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato in parte da Natural Science Foundation di Cina sovvenzioni nazionali (31370813, 3147670, 31670831 e 31600672,), la nazionale transgenici pianta speciale fondo (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), programma per nuovi talenti eccellenti di secolo in Università, la chiave della ricerca nazionale e progetto di sviluppo della Cina (2016YFA0500601) e Cina Postdoctoral Science Foundation (2016M 591667).
Materials
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
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