이 프로토콜에서 작동 하기 쉬운 여러 핵 산의 비주얼 검색 적용 될 수 있는 작은, 준비-사용 카세트의 제작을 설명 합니다. 이 방법에서는, 모 세관 배열 멀티플렉스 및 고효율 검출 조합 목표의 사용 되었다.
다중 대상, 짧은 시간, 그리고 단일 테스트 운영 하 게 쉬운에서 여러 핵 산의 검출에 대 한 리소스-저렴 한 방법론은 절실히 필요 질병 진단, 미생물 모니터링, 유전자 변형된 생명체 (GMO) 검출, 그리고 법정 분석입니다. 우리는 이전 진정 (Capillary Array 기반 Loop 중재 등온 증폭 핵 산의 Multiplex 비주얼 검색) 라는 플랫폼을 설명 했습니다. 여기, 우리는 향상 된 제조 및 성능 프로세스가이 플랫폼에 대 한 설명. 여기, 우리는 작은, 준비-사용 카세트 핵 산의 다중 영상 검출을 위한 모 세관 배열에 의해 조립 적용. 모 세관 배열 고정 루프 중재 등온 증폭 (램프) 뇌관 세트 모세 혈관에 전에 미리 소수 성 및 친수성 패턴으로 치료 이다. 로드 어댑터의 조립 후 램프 반응 혼합물은 로드 하 고 각 모 세관, 단일 pipetting 단계에 의해 모 세관 힘 때문에 고립. 램프 반응 모세 혈관에서 병렬로 수행 됩니다. 결과 휴대용 자외선 손전등 조명에 의해 밖으로 시각적으로 읽혀집니다. 이 플랫폼을 사용 하 여, 8 자주 높은 특이성 및 감도 요소와 GMO 샘플에서 유전자 표시의 모니터링 설명 합니다. 요약 하면, 여기에 설명 된 플랫폼 여러 핵 산의 탐지를 촉진 하기 위한 것입니다. 우리는 높은 처리량 핵 산 분석 필요 분야에 광범위 하 게 적용 될 것입니다 믿습니다.
여러 핵 산의 동시 검출을 위한 저가, 빠르고 사용 하기 쉬운 시스템 분야, 임상 진단1,2,3, GMO 검출4, 넓은 범위에서 긴급 하 게 필요 5,6,7,,89, 정밀 분석10,11, 그리고 특히 포인트의 케어 테스트 (POCTs), 어디 모니터링 미생물 자원 일반적으로 제한12,,1314있습니다.
연쇄 반응 (PCR), 실시간 PCR 및 멀티플렉스 PCR 파생 메서드를 포함 하 여 검출이 분야에 가장 널리 적용된 기술입니다. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 검색 한 대상 한 테스트15 및 전기 및 정교한 전문 장비 필요한.
핵 산 탐지 하기 위한 또 다른 유망한 기술이 이다 루프 중재 등온 증폭 (램프)는 처음 200016에 설명 했다. 램프는 고효율 DNA 검출 방식 이다. 이론적으로, 그것은 수 있는 증폭 1 복사본에서 amplicons 109 복사본을 일정 한 온도, (즉, 60-65 ° C 사이)에서 모두 1 시간 이내. 성공적인 증폭 불용 성 부산물 파이 인산의 대량 생산 하 고 탁도17, 맨 눈으로 직접 관찰 될 수 있는 변경 될 것입니다. 색상 변화는 또한 금속 이온 또는 Calcein18, 핵 산 염색19, hydroxyl naphthol 블루20등 형광 염료의 추가 의해 관찰할 수 있습니다. 높은 감도의 장점과 운영의 편의 때문에 램프는 핵 산 탐지에서 넓게 적용 되 고.
현재, 다중 램프 분석 실험을 위한 주로 두 가지 전략이 있다. 하나는 여러 개의 램프를 갖는 다중 램프 분석 수행 하는 뇌관 1 개의 관21,,2223에 설정 합니다. 그러나, 복합성 및 증폭 효율 본질적인 간섭 및 다른 뇌관 세트 간의 경쟁에 의해 제한 될 것 이다. 또한, 그것은 다른 램프 제품 같은 반응에 어려울 수 있습니다. 또 다른 전략은 물리적 격리를 기반으로 합니다. 다른 뇌관 세트 개별 소형된 구획으로 고립 되었다 및 다중 램프 반응을 동시에 수행 됩니다 다음24,25. 미세 칩에 따라 일반적으로, 이러한 접근 높은 처리량 램프 반응에 대 한 잠재적인 솔루션을 제공 합니다. 그러나, 칩의 제조 및 뇌관 세트의 다중 사전 코팅은 복잡, 비용 증가 재현성을 줄일 수 있습니다.
최근, 몇 가지 연구는 미세 칩의 복잡 한 제조를 무시 하 고 저 비 탐지26,27달성에 모 세관에서 수행 램프 반응을 설명 했습니다. 그러나, 높은 처리량 분석에 관해서는 이러한 모세 혈관은 비슷합니다 PCR 스트립 튜브의 미니어처 버전 샘플 및 반응 시 약 (를 포함 하 여 다른 뇌관 세트) 개별적으로 준비 하 고 해야 합니다 다른에 게 전달 하기 때문에 모세 혈관 내에서 반응 단위입니다. 병렬 및 다중 분석을 달성 하기 위해 추가 장비, 예를 들어 멀티 채널 주사기 펌프는 샘플 또는 시 약의 병렬 로드에 대 한 필요 합니다.
핵 산의 다중 검출을 위한 현재 메서드에 연결 된 한계를 극복 하기 위해 우리 모 세관 배열로 시각적 램프 기술을 결합 하는 소형된 플랫폼을 개발 했습니다. 이 플랫폼은 다중 대상, 소형 크기, 낮은 비용, 그리고28를 운영 하 게 쉬운. 여기, 모 세관 배열 조작 배열에 램프 반응을 수행 하는 방법의 세부 사항을 설명 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 모델 유전자 변형된 유기 체 (GMO) 검출을 사용 하 여 표준화 되어 있다. 중요 한 것은,이 프로토콜 다른 핵 산 대상의 높은 처리량 검색에도 사용할 수 있습니다.
진정 플랫폼 시연, 여기는 모 세관 배열 램프 기술을 결합, 단일, 매우 효과적이 고 테스트를 운영 하 게 쉬운에서 여러 유전자 GMO 관련 목표의 동시 탐지를 가능 하 게.
카세트에서 다중 램프 반응을 성공적으로 수행 하려면 세 가지 중요 한 포인트 주의 될 필요가 있다. 첫째, 모세 혈관의 상부 및 모 세관 배열의 친수성 및 소수 성 패턴에 대 한 동일한 높이 달성가 동시에 모?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구에서 새로운 세기 뛰어난 재능에 대 한 국가 자연 과학 재단의 중국 보조금 (31370813, 3147670, 31670831 및 31600672,), 국립 유전자 변형 식물 특별 기금 (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), 프로그램 부분에 투자 되었다 대학, 국가 주요 연구 및 개발 프로젝트 (2016YFA0500601) 중국과 중국 박사 후 과학 재단 (2016 M 591667).
UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |