Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama
Summary
Bu iletişim kuralı birden fazla Nükleik asitlerin kullanımı kolay bir tek, testinde görsel algılama için uygulanan küçük, kullanıma hazır bir kaset imalatı açıklar. Bu yaklaşım, kılcal bir dizi GDO hedefleri çok katmanlı ve yüksek verimli tespiti için kullanıldı.
Abstract
Çoklu hedef, kısa süre ve kaynak uygun yöntemlerden birden çok nükleik asitler tek bir test kolay tespiti için acilen ihtiyaç vardır hastalık tanı, mikrobiyal izleme, genetiği değiştirilmiş organizma (GDO) algılama, ve adli analiz. Sakin (Capillary Array tabanlı Loop-aracılı izotermal amplifikasyon Multiplex nükleik asitler görsel algılanması için) olarak adlandırılan platformu daha önce anlatmıştık. Burada, geliştirilmiş imalat ve bu platform için performans işlemleri açıklanmaktadır. Burada, Nükleik asitlerin multiplex görsel algılama için kılcal dizi tarafından monte küçük, kullanıma hazır bir kaset geçerli. Kılcal damar kılcal damarlar içinde izotermal amplifikasyon (lamba) döngü-aracılı astar setleri sabitleme önce bir hidrofobik ve hidrofilik kalıp içine önceden tedavi dizidir. Sonra derleme yükleme bağdaştırıcısının lamba tepki karışımı yüklü ve tek bir pipetting adım kapiller zorla nedeniyle her kılcal damar içine izole. LAMBA reaksiyonlar kılcal paralel gerçekleştirilir. Sonuçları görsel olarak el UV el feneri ile aydınlatma tarafından okunur. Bu platformu kullanarak, sık sık yüksek özgüllük ve duyarlılık ile öğeleri ve GDO örnekleri genlerinde görünmüyor 8 izleme göstermektedir. Özetle, burada açıklanan platformu birden çok nükleik asitler algılama kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Biz alanlarında yüksek üretilen iş nükleik asit analizi gerekli olduğu yerde geçerli olacağına inanıyoruz.
Introduction
Aynı anda birden fazla nükleik asitler tespiti için düşük maliyetli, hızlı ve kullanımı kolay sistemleri Klinik teşhis1,2,3, GDO algılama4gibi alanlarda geniş bir alanda acilen ihtiyaç vardır, 5,6,7,8,9, analiziniz10,11ve özellikle nokta-in-bakım testleri (POCTs), nerede izleme mikrobiyal kaynaklar genellikle sınırlı12,13,14vardır.
Polimeraz zincir tepkimesi (PCR), gerçek zamanlı PCR ve çoklu PCR, türev yöntemleri de dahil olmak üzere bu alanlardaki algılama için en yaygın olarak uygulanan bir tekniktir. Ancak, bu yöntemler genellikle sadece bir hedef bir test15 dakika içinde algılamak ve elektrik ve sofistike profesyonel ekipman gerektirir.
Nükleik asitler algılamak için başka bir gelecek vaat eden ilk tarif eden 200016izotermal amplifikasyon (lamba), döngü-aracılı teknolojisidir. LAMBA yüksek verim DNA algılama yöntemi vardır. Teorik olarak, tek bir sabit sıcaklık, (Yani, 60-65 ° C arasında) gerçekleştirilen bir saat içerisinde amplicons 109 kopya 1 kopya yükseltmek. Başarılı amplifikasyon çözünmez yan ürünü pirofosfat büyük miktarda üretmek ve bulanıklık17doğrudan çıplak gözle tarafından gözlenen, bir değişiklik neden. Renk değişikliği, metal iyonları veya floresan boyalar Calcein18, nükleik asit boya19ve hidroksil naftol mavi20gibi eklenmesi tarafından da görülebilir. Yüksek hassasiyet avantajları ve işlem kolaylığı nedeniyle, lamba nükleik asit algılama içinde yaygın olarak uygulanmaktadır.
Şu anda, başlıca iki stratejiler multiplex lamba deneyleri için vardır. Biri birden çok lamba alarak birden fazla lamba deneyleri gerçekleştirmeye astar ayarlar içinde bir tüp21,22,23. Ancak, çokluğu ve amplifikasyon verimliliği iç parazit ve farklı astar kümeleri arasında rekabet tarafından sınırlı. Ayrıca, farklı lamba ürünleri aynı tepki olarak tanımlamak zor olabilir. Başka bir strateji üzerinde fiziksel yalıtım dayanmaktadır. Farklı astar kümeleri bireysel küçültülmüş bölmeleri izole ve birden çok lamba reaksiyonlar sonra aynı anda gerçekleştirilen24,25. Genellikle mikrosıvısal çip üzerinde temel alır, bu yaklaşımların yüksek üretilen iş lamba reaksiyonlar için olası bir çözüm sunar. Ancak, cips üretimi ve multiplex öncesi kaplama astar kümeleri karmaşıktır maliyetleri artırmak ve tekrarlanabilirlik azaltmak.
Son zamanlarda, bazı çalışmalar mikrosıvısal çip karmaşık imalatı bypass ve düşük maliyetli algılama26,27elde ettik kılcal performanslı lamba tepkileri anlatmıştık. Örnekleri ve reaksiyon Kimyasalları (farklı astar kümeleri dahil olmak üzere) olmalı ayrı ayrı hazırlanan ve farklı teslim çünkü ancak, yüksek üretilen iş analizi açısından, bu kılcal PCR şerit tüpler, minyatür sürümleri için benzer reaksiyon biriminde bulunan kılcal damarlar. Paralel ve çok katmanlı analiz elde etmek için örnekleri ya da reaktifler paralel yükleme için ek donanımları, örneğin bir çok kanallı şırınga pompa, gereklidir.
Nükleik asitler multiplex algılanması için geçerli yöntemleri ile ilişkili sınırlamalarını aşmak için kılcal bir dizi görsel lamba teknoloji birleştiren bir minyatür platformu geliştirdi. Bu platform çoklu hedef, kompakt, düşük maliyetli ve kolay28çalışmasına boyutu. Burada, kapiller dizi imal ve lamba reaksiyonlar dizideki gerçekleştirmek nasıl ayrıntıları açıklamak. Burada açıklanan protokol genetiği değiştirilmiş organizma (GDO) algılama bir model olarak kullanarak standart. Önemlisi, bu iletişim kuralı diğer nükleik asit hedefler yüksek üretilen iş tespiti de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, sakin platformu gösterdi hangi lamba teknolojisi ile kılcal bir dizi birleştiren, aynı anda birden çok gen GDO ile ilgili hedef tek bir son derece etkili ve kolay test çalışmasına tespiti sağlar.
Multiplex lamba reaksiyonlar kasete başarıyla uygulamak için üç kritik noktaları fark gerekir. İlk olarak, kılcal üst tarafında ve kapiller dizi hidrofilik ve hidrofobik desen için aynı yükseklikte ulaşmak reaktifler tüm kılcal aynı anda yüklemek için kritik. İlk …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada kısmen Ulusal doğal Bilim Vakfı, Çin hibe (31370813, 3147670, 31670831 ve 31600672,), ulusal transjenik bitki özel Fonu (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), Program tarafından yeni yüzyıl mükemmel yeteneklerini için finanse edildi Üniversitesi, ulusal anahtar araştırma ve geliştirme projesi (2016YFA0500601) Çin ve Çin doktora sonrası Bilim Vakfı (2016M 591667).
Materials
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
- Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
- Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
- Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
- Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how?. J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
- Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
- Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
- Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
- Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
- Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
- Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
- Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
- Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
- Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
- Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
- Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
- Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
- Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
- Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
- Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).
