Визуального обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в массиве капилляров
Summary
Этот протокол описывает изготовление малых, готовых к использованию кассеты, которые могут быть применены для визуального обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в единый, тест, который прост в эксплуатации. В этом подходе капиллярные массив был использован для мультиплекс и высокоэффективного обнаружения целей ГИО.
Abstract
Срочно необходимы нескольких целей, короткое время и ресурс доступные методологии для обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в единый, простой в эксплуатации тест в диагностике заболеваний, микробной мониторинг, обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО), и судебно-медицинской экспертизы. Ранее мы описали платформы, называется спокойствия (Capillary Aна основе rray LООП опосредованной изотермической амплификация Multiplex визуального обнаружения нуклеиновых кислот). Здесь мы описываем, совершенствование производства и производительности процессов для этой платформы. Здесь мы применяем небольшой, готовых к использованию Кассета собрана капиллярной массив для мультиплекс визуального обнаружения нуклеиновых кислот. Капиллярные массив предварительно обработанные в шаблон гидрофобных и гидрофильных перед закреплением цикла опосредованной изотермической амплификация (лампа) грунт наборы в капиллярах. После сборки адаптера для загрузки лампа реакционную смесь загружается и изолированных в каждой капилляров, благодаря капиллярные силы один шаг дозирования. ЛАМПА реакции выполняются параллельно в капиллярах. Результаты являются визуально зачитал освещения с портативных Фонарик УФ. С помощью этой платформы, мы демонстрируем, мониторинг 8, часто появляются элементы и гены в образцах ГИО с высокой специфичности и чувствительности. Таким образом платформа, описываемые предназначен для облегчения обнаружения нескольких нуклеиновых кислот. Мы считаем, что это будет широко применяться в областях, где высок объём нуклеинокислотный анализ не требуется.
Introduction
В широком диапазоне областей, таких как диагностика1,2,3, ГИО обнаружения4, срочно необходимы недорогой, быстрый и простой в использовании системы для одновременного обнаружения нескольких нуклеиновых кислот 5,6, микробных контроля7,8,9, криминалистического анализа10,11и особенно точки обслуживания тестов (POCTs), где ресурсы Это обычно ограничен12,,1314.
Полимеразной цепной реакции (ПЦР), включая его производные методы ПЦР в реальном времени и мультиплексной ПЦР, является наиболее широко применяемым методом для обнаружения в этих областях. Однако эти методы обычно только обнаруживать цели в один в один тест15 , и они требуют электричества и современное профессиональное оборудование.
Другой многообещающей технологии для обнаружения нуклеиновые кислоты-петля опосредованной изотермической амплификация (лампа), который был впервые описан в 2000 году16. ЛАМПА является высокая эффективность метода обнаружения ДНК. Теоретически это может усилить от 1 экземпляра 109 копий ампликонами, в течение одного часа, все выполняется при постоянной температуре, (то есть, между 60-65 ° C). Успешное усиление будет производить большое количество нерастворимых побочным пирофосфат и приводит к изменению мутности17, который можно непосредственно наблюдать невооруженным глазом. Изменение цвета может также наблюдаться добавлением металлических ионов или флуоресцентными красителями Флуорексон18, нуклеиновые кислоты краситель19и гидроксила Нафтол синий20. Из-за преимущества высокой чувствительностью и удобство эксплуатации лампа широко применяется в обнаружения нуклеиновой кислоты.
В настоящее время главным образом две стратегии для мультиплекс лампа анализов. Один — выполнить несколько анализов лампа, имея несколько лампа грунтовка задает в одной из труб21,,2223. Однако множественности и усиления эффективности будет ограничиваться внутренней вмешательства и конкуренция между различными грунтовка наборы. Кроме того это может быть трудно определить различные продукты лампа в такую же реакцию. Другая стратегия основана на физической изоляции. Наборы различных грунтовка были изолированы в отдельных миниатюрных отсеков, и затем одновременно выполняются несколько реакций лампа24,25. Эти подходы, которые как правило основаны на microfluidic фишки, обеспечивают потенциальное решение для высокой пропускной способности лампа реакций. Однако, производство чипов и мультиплексной Предварительное покрытие грунт наборов сложных, которые могут увеличить издержки и уменьшить воспроизводимость.
Недавно несколько исследований описал исполняющая лампа реакции в капиллярах обойти сложные изготовление microfluidic чипов и достигли лоу кост обнаружения26,27. Однако относительно высок объём анализа, эти капилляры похожи на миниатюрные версии ПЦР газа трубок, потому что образцы и реагенты реакции (включая наборы различных грунтовка) должны быть индивидуально подготовлен и доставлены в различные реакция подразделения капилляров. Для достижения анализа параллельных и мультиплекс, дополнительное оборудование, например многоканальный шприцевый насос, является обязательным для параллельной загрузки образцов или реагенты.
Чтобы преодолеть ограничения, связанные с текущими методами для мультиплекс обнаружения нуклеиновых кислот, мы разработали миниатюрных платформу, которая сочетает в себе технологию визуального лампа с массивом капилляров. Эта платформа нескольких целей, компактный размер, низкая стоимость и легко работать28. Здесь мы описываем подробности о том, как изготовить капиллярного массив и выполнять лампа реакции в массиве. Протокол, описанные здесь был унифицирован с использованием генетически измененных организмов (ГИО) обнаружения как модель. Важно отметить, что этот протокол может использоваться также в высокой пропускной способности обнаружения других целей нуклеиновых кислот.
Protocol
Representative Results
Discussion
СПОКОЙНЫМ платформы продемонстрировали здесь, который сочетает в себе технологии лампы с массивом капилляров, позволяет одновременное обнаружение нескольких генов, связанных с ГИО целей в единый, высоко эффективный и простой в эксплуатации тест.
Чтобы успешно выполнит…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось частично национальных естественных наук из Китая гранты фонда (31370813, 3147670, 31670831 и 31600672,), Национальный трансгенных растений Специальный фонд (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), программа для нового века отличные таланты в Университет, национальных исследований и проект развития Китая (2016YFA0500601) и Китай Докторантура научный фонд (2016 М 591667).
Materials
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
- Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
- Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
- Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
- Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how?. J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
- Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
- Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
- Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
- Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
- Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
- Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
- Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
- Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
- Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
- Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
- Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
- Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
- Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
- Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
- Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).
