Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

الفرز على نطاق الجينوم [رني] تحديد العوامل المضيفة التي تعدل علاج فيروس أونكوليتيك

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/56913
Automatic Translation
1,2, 1,4, 1, 1, 1,2,3
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Summary

هنا يمكننا وصف بروتوكول لاستخدام الفرز [رني] الفائق لكشف أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز العلاج الفيروسات أونكوليتيك، ويمكن على وجه التحديد رهابودفيروس واللقاحيه العلاج بالفيروسات، ولكن سهولة تكييفها للأخرى أونكوليتيك برامج الفيروسات أو لاكتشاف الجينات المضيفة التي تعدل النسخ المتماثل الفيروس عموما.

Abstract

الفائق على نطاق الجينوم [رني] (تدخل الجيش الملكي النيبالي) فحص تكنولوجيا تستخدم على نطاق واسع لاكتشاف العوامل المضيفة التي تؤثر على فيروس النسخ المتماثل. نقدم هنا تطبيق هذه التكنولوجيا لكشف أهداف المضيف التي تعدل على وجه التحديد النسخ المتماثل من فيروس مارابا، رهابدوفيروس أونكوليتيك، وفيروس اللقاحية بهدف تعزيز العلاج. حين تم اختبار البروتوكول للاستخدام مع وفيروس مارابا أونكوليتيك أونكوليتيك اللقاحية، هذا النهج ينطبق على غيره من الفيروسات أونكوليتيك، ويمكن أيضا أن تستخدم لتحديد أهداف المضيف أن تعدل النسخ المتماثل الفيروس في خلايا الثدييات في العامة. ويصف هذا البروتوكول التنمية والتحقق من الصحة للفحص للفرز الفائق [رني] في خلايا الثدييات، والاعتبارات الرئيسية وإعداد خطوات هامة لإجراء شاشة [رني] الفائق الأولية، ودليل خطوة بخطوة إجراء شاشة [رني] الفائق الأولية؛ وباﻹضافة إلى ذلك، وهو يجمل على نطاق واسع أساليب لإجراء التحقق من صحة الشاشة الثانوية والدراسات الجامعية التحقق من الصحة. الاستفادة من الفحص هو أنه يسمح لأحد الكتالوج، بطريقة شاملة وغير متحيزة، عوامل المضيف أن تعدل أي جانب من النسخ المتماثل الفيروس الذي واحد يمكن أن تتطور فحص في المختبر مثل العدوى، [رني] الفائق انفجر الحجم، وسيتوتوكسيسيتي. لديه القدرة على كشف biotherapeutic أهدافا غير متوقعة استناداً إلى المعرفة الحالية.

Introduction

الفرز الفائق على نطاق الجينوم [رني] ثبت أن تكون أداة لا تقدر بثمن للكشف عن رؤى البيولوجي في مجالات متنوعة للدراسة بما في ذلك فيروس البيولوجيا. على مدى العقد الماضي أو نحو ذلك، قامت العديد من الجماعات يستند إلى الخلية الفرز [رني] على نطاق واسع على نطاق واسع في تحديد الجينات المضيفة التي تعدل فيروس النسخ المتماثل (المراجعة في1،2،3،4 , 5 , 6 , 7)-من المثير للاهتمام، وعدد كبير من هذه الشاشات أجريت في الخلايا السرطانية والعديد من فيروسات الحالي أونكوليتيك الفيروسات المرشحة بما في ذلك اللقاحية الفيروسات8،9،10 ، ميكسوما الفيروسات11فيروس الحلأ البسيط12،13،فيروس التهاب الفم الحويصلي14ومارابا الفيروس15. بينما كان تركيز معظم هذه الدراسات على تحديد العوامل المضيفة التي تؤثر على بعض جوانب فيروس النسخ المتماثل وليس على تحديد أهداف بيوثيرابيوتيك لتعزيز العلاج فيروس أونكوليتيك، يمكن أن تستخرج بيانات قيمة من هذه المجموعات من البيانات في هذا الصدد. فمن الواضح أن إمكانات قوية لتحديد أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز أونكوليتيك الفيروس العلاج لم تستغل بالكامل.

ويجري حاليا اختبار عدد كبير منصات فيروس أونكوليتيك في الدراسات السريرية والسريرية بما في ذلك فيروس القوباء الفيروسات، ريوفيروس واللقاحيه البسيط، الذي كان النجاح الملموس في وقت متأخر من مرحلة التجارب السريرية. لغالبية هذه المنابر، توجه الجهود نحو تغيير جينومات الفيروس لتعزيز العلاج. على سبيل المثال، لزيادة نوعية الورم، جينات الفيروس محددة تم حذف أو تحور لتحد بشكل كبير الفيروسية النسخ المتماثل في الخلايا الطبيعية، ولكن ليس في الخلايا السرطانية. في بعض الحالات، تم إضافة المتسلسلات مثل GM-CSF (عامل تحفيز مستعمرة بلعم المحببات) تحفيز الاستجابة المناعية أو شيكل (سيمبورتير يوديد الصوديوم) لتمكين فيفو في التصوير، وامتصاص راديويوديدي الخلوية للعلاج الأغراض. ومع ذلك، كان هناك القليل جداً العمل ركزت على التلاعب بالجينات المضيف/الورم واستكشاف أثر الجينات المضيف/ورم في أونكوليتيك فيروس النسخ المتماثل. ومع ظهور تكنولوجيا الفرز الفائق، فمن الممكن للتحقيق التفاعلات المضيف الفيروس على نطاق جينوم وفك فرصاً للتلاعب جينوم مضيف لتعزيز أونكوليتيك الفيروس العلاج الآن (استعرض في16، 17،18).

أبلغنا أول دراسة تبين دليل على المفهوم لاستخدام الفائق الوراثية الفحص لتحديد أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز العلاج فيروس أونكوليتيك. لاكتشاف الجينات المضيفة التي تعدل مارابا فيروس أونكوليسيس، رهابدوفيروس أونكوليتيك يجري اختباره حاليا في المرحلة الأولى والثاني المحاكمات، أجرينا شاشات [رني] على نطاق الجينوم عبر ثلاثة خطوط الخلايا الورم المختلفة في تكرار مع siRNA (التدخل في الجيش الملكي النيبالي قصيرة) مكتبة استهداف جينات 18,12015. كشف تحليل مسار الزيارات المحددة في الشاشات إثراء الأعضاء في مسارات استجابة الإجهاد ER (هيولى). اخترنا 10 مرات داخل هذه المسارات للثانوي التحقق من الصحة باستخدام siRNA مع تسلسل استهداف مختلفة عن تلك الخاصة بالشاشة الرئيسية. وكجزء من التحقق من التعليم العالي، وقد أجرينا تجربة إنقاذ مع IRE1α (التي تتطلب اينوزيتول ألفا إنزيم 1) للتأكد من أنه الضرب على الهدف. في المختبر و في فيفو الاختبار باستخدام مثبط جزيء صغير من IRE1α أسفرت عن فعالية أونكوليتيك زيادة هائلة.

ووركينهي et al. كما أجرى 12 شاشة [رني] على نطاق جينوم شرنا لينتيفيرال مجمعة (دبوس الشعر القصير الرنا) باستخدام مكتبة استهداف جينات 16,056 لتحديد العوامل المضيفة تقييد البشرية فيروس الهربس البسيط نوع 1 (هامبورغ-1) متحولة بوساطة KM100 أونكوليسيس من الثدي الخلايا السرطانية. في الشاشة الرئيسية، وحددوا الجينات 343 ضربة قاضية لتؤدي إلى سيتوتوكسيسيتي المعززة للخلايا المصابة KM100 عبر الخلايا المصابة وهمية؛ أنها اختارت 24 من هذه الجينات للتحقق من الثانوي. وتأكدت من أصل 24 الجينات، الجينات 8 في الشاشة الثانوية مع واحد منهم يجري SRSF2 (الربط سيرين/ارجينين--الغنية بعامل 2) الذي أكد في وقت لاحق باستخدام تجربة إنقاذ وراثية أثناء التحقق من التعليم العالي. توجهت المجموعة تحديد مثبط topoisomerase الحمض النووي التي العلاج الكيميائي التي خفضت الفسفرة SRSF2 وأظهرت أن علاج تركيبة KM100 هامبورغ-1 مع هذا المانع يؤدي إلى بقاء تمديد أنبوب الفئران الحاملة للورم.

وتلت في الدراسات السالفة الذكر، سير عمل مشابهة. وبدأت كل مع شاشة [رني] على نطاق جينوم أساسي متبوعاً شاشة ثانوية في عدد مختار من الزيارات المحددة في الشاشة الرئيسية. وتلت ذلك دراسات التعليم العالي التحقق من الصحة، التي تضمنت تأكيد أنه الضرب على الهدف قبل تنفيذ الوراثية الإنقاذ تجارب في المختبر مع التحقق من الصحة في نهاية المطاف يؤديها التلاعب المنتج الجينات المستهدفة في فيفو. في هذه المقالة، نحن نقدم أولاً بروتوكول عام للتنمية والتحقق منها مقايسة siRNA-الفرز الفائق، الذي ينطوي على تحديد شروط تعداء الأمثل، كمية الفيروس، وطول مدة الإصابة. نحن نقدم أيضا بروتوكول مفصلة لإجراء أولى شاشة siRNA الفائق، فضلا عن وصف عام لطريقة لإجراء التحقق من صحة الشاشة الثانوية والثالثية التحقق من صحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-التنمية والتحقق من siRNA الفائق فحص الإنزيم

ملاحظة: لجميع التجارب، استخدام وسائط النمو حبيس مخزنة المناسبة لكل خط الخلية. انظر الشكل 1 لمحة عامة لسير العمل من التحليل الأمثل للتحقق من التعليم العالي.

  1. تحديد شروط تعداء الأمثل
    1. حدد خط خلية ورم أو مثالي خلايا الورم عدة خطوط لتحسين ظروف تعداء (مثلاً س 786، NCI-H226، SF268، U373، واوفسار-8، U20S؛ انظر النقاش لمزيد من المعلومات حول اختيار خطوط الخلايا).
    2. حدد كاشف تعداء أو عدة لاختبار. قد يكون ضروريا لاختبار عدة تعداء الكواشف، كما قد تكون بعض السمية أو أكثر كفاءة من غيرها في خط خلية معينة. أيضا، ضع في اعتبارك أن بعض قد تؤثر على الإصابة بعدوى الفيروس أو قد تولد إشارة خلفية عالية عند التصوير.
    3. تقرر على الإيجابية [ه. غ. siRNA استهداف مرناً PLK-1(Polo Like Kinase 1)، مما يؤدي إلى موت الخلية] وسلبية تعداء عناصر تحكم (مثل عدم استهداف siRNA).
    4. يتبع البروتوكول تعداء العكسية للكاشف تعداء خاصة، ولكن تختلف كمية تعداء كاشف (مثل 0.05، 0.1، 0.15 و 0.2 جيدا/ميكروليتر) وخلية البذر الكثافة (مثل 625، 1250، 2500 خلايا/جيد). وتشمل replicates الشروط التالية: دون علاج الخلايا، صورية transfected الخلايا (أي الخلايا بالإضافة إلى كاشف تعداء)، والخلايا transfected مع siRNA التحكم تعداء الإيجابية والسلبية (انظر الشكل 2 ألف للوحة عينة التخطيط).
      1. وبصفة عامة، تعد 80 نانومتر تخفيف من كل siRNA لتركيز نهائي في البئر من 10 نانومتر (تبعاً للمكتبة، وتركيز أعلى من siRNA قد تكون مطلوبة). ما لم يذكر خلاف ذلك، يضعف siRNA مع الكاشف تعداء مادة. إعداد تخفيف الكاشف تعداء.
      2. بيبيت 5 ميكروليتر siRNA كل بئر تليها 5 ميكروليتر من كاشف تعداء المخفف. لتسهيل هذه الخطوة، توزع على طول عمود لوحة 96 يو-أسفل بئر ويمزج siRNA ومخفف siRNA وحدها (لغير المعالجة وصورية transfected الخلايا). توزيع على طول عمود ثاني وكاشف تعداء المخفف تعداء كاشف مخفف وحدها (للخلايا غير المعالجة).
        1. استخدام بيبيت الإلكترونية، بيبيت 5 ميكروليتر/جيدا من محتويات العمود الأول الذي يحتوي على siRNA أو siRNA مادة إلى الآبار المقابلة للوحة 384-جيدا تليها 5 ميكروليتر/بئر كاشف تعداء المخفف أو كاشف تعداء مادة من العمود الثاني.
      3. الطرد المركزي اللوحات في غ س 1026 لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، واحتضان للوقت المحدد للكاشف تعداء (مثلاً 5-20 دقيقة).
      4. بينما هي تفرخ اللوحات، إعداد تعليق خلية من كثافات مختلفة. بيبيت 30 ميكروليتر تعليق الخلية الواحدة وكذلك. قبل وضع اللوحات في الحاضنة، واسمحوا لوحات الجلوس لمدة 45-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بتسوية موحدة من خلايا19.
        ملاحظة: إذا كانت فترة الحضانة المنصوص عليها للكاشف تعداء مع siRNA قصيرة، إعداد تعليق خلية قبل الحضانة.
      5. احتضانها ح 48 إلى 72 حسب الطول المطلوب لضربة قاضية المختار للشاشة.
    5. تعد إصلاح وتلطيخ حل يتكون من فورمالدهايد، هويشت 33342 وبرنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة) لتركيز نهائي في كل بئر من 4% فورمالدهايد و 5 ميكروغرام/مل من هويشت 33342. حسب الحاجة، حاول أحد أعلى (مثلاً 7.5 ميكروغرام/مل) أو تركيز أقل (مثل 2 ميكروغرام/مل) من هويشت إذا كانت الإشارة ضعيفة جداً أو قوية جداً، على التوالي.
    6. الاستغناء عن 30 ميكروليتر المصبوغة وتحديد الحل مباشرة في جميع الآبار. احتضان لوحات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية. في حالة استخدام مجهر غير [كنفوكل]، يغسل اللوحات مع برنامج تلفزيوني استخدام غسالة لوحة؛ وفي معظم الحالات، الغسل غير ضرورية عند استخدام مجهر [كنفوكل].
    7. تطوير برنامج نصي لقياس عدد الخلايا كل بئر.
      ملاحظة: هناك عدة أجنحة البرمجيات المتاحة لهذا الغرض، وفي حين قد يكون لكل طرق مختلفة لإنشاء البرامج النصية، لديهم كل شيء عموما وسيلة لتحديد الأنوية والخلايا والمناطق ذات الاهتمام، فضلا عن حساب الكثافات و الخصائص المورفولوجية. عند تطوير البرنامج نصي فرز، من المهم النظر في الوقت المطلوب لتشغيل البرنامج النصي للوحة الواحدة وربما تشمل القياسات الأساسية فقط لتقليل الوقت اللازم للتجهيز. على سبيل المثال، لتحديد عدد الخلايا، واحد قد حساب مساحة هويشت كل بئر أعلاه كثافة محددة؛ وتحديد حجم انتشار الفيروس، واحد قد حساب المنطقة (بروتين فلوري أخضر) التجارة والنقل في كل بئر أعلاه كثافة محددة. البرنامج النصي "انخفاضها إلى أسفل" ستحتاج إلى مقارنة بالسيناريو أكثر تفصيلاً لضمان يتم فقدان أية معلومات أساسية.
    8. تحليل النتائج تحديد شروط تعداء الأمثل لكمية كاشف تعداء والخلية البذر الكثافة يؤدي إلى موت الخلية كبيرة (0-30% بقاء الخلية)، وهو الحد الأدنى السامة للخلايا (مثل 90-100% بقاء الخلية). ملاحظة: قد يستغرق وقتاً أطول لمراقبة النمط الظاهري موت الخلية في خطوط الخلايا بإضعاف مضاعفة فترة طويلة. انظر الشكل 2 ج 2 لنتائج تمثيلية. أيضا، ضمان أن الخلايا transfected مع عدم استهداف siRNA حوالي 90-100% روافد في وقت التثبيت كما في وقت لاحق واحدة تريد أن تصيب الخلايا الموجودة في هذا كونفلوينسي.
  2. تحديد كمية الفيروس الأمثل وطول الإصابة
    1. نفذ الخطوات تعداء عكس نفسه كما هو موضح أعلاه (انظر 1.1.4.1 إلى 1.1.4.4)؛ ومع ذلك، استخدام الشروط المثلى تعداء فقط (انظر 1.1.8) (مثلاً للخلايا 786-س: 1500 خلايا/حسنا ومن رنيم 0.05 ميكروليتر/جيدا)، وعلاوة على ذلك، تشمل آبار إضافية للإصابة بالفيروس [مثل الآبار مع الخلايا غير المعالجة، وهمية transfected الخلايا، خلايا transfected مع عدم استهداف siRNA وخلايا transfected مع عناصر إيجابية الفيروس إذا كانت تلك معروفة (أي siRNA استهداف الجينات المضيفة التي سوف تمنع أو تحسين النسخ المتماثل)].
      1. انظر الشكل 3 ألف لتخطيط لوحة عينة. احتضانها ح 48-72.
    2. يصيب الآبار فيروسات إضافية بفيروس أونكوليتيك التعبير عن بروتين مراسل فلورسنت (مثل التجارة والنقل) مع طائفة من التعدديات العدوى (MOIs) (مثلاً 0.001 إلى 10؛ النطاق المختار أن سيتوقف على مستوى المقاومة أو التعرض لخط الخلية.). وتشمل الآبار غير مصاب كذلك. بيبيت 40 ميكروليتر من كل تمييع الفيروس كل بئر لوحدة تخزين نهائي من 80 ميكروليتر. الطرد المركزي كل لوحة في 400 غ س لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. العدوى التالية، الصورة الخلايا العيش مع عالية--محتوى، الآلي المجهر على فترات منتظمة (مثلاً كل ح 4-8). انظر الشكل 3 و ج 3.
    4. تطوير برنامج نصي تحديد حجم انتشار الفيروس (مثل التجارة والنقل في المنطقة الواحدة وكذلك) (انظر 1.1.7). تحليل الصور وحدد وقت نقطة ووزارة الداخلية التي تسمح بالكشف عن الزيادة والنقصان في انتشار. ضمان النقطة الزمنية وسقوط وزارة الداخلية ضمن نطاق خطي لتيسير الكشف عن التغيرات الصغيرة في انتشار. تقدير Z-عامل (أو Z ') للنقطة وقت معين ووزارة الداخلية.
      ملاحظة: تشير التقديرات إلى Z-عامل = 1-3 (σف + σن)/| μ-μفن| وحيث σف هو الانحراف المعياري للعينة من عناصر إيجابية الفيروس و σn هو الانحراف المعياري للعينة من الفيروس سلبية الضوابط؛ وهو μف متوسط العينة عناصر إيجابية الفيروس و μن متوسط العينة من عناصر سلبية. عامل زي ما يقدر 0.5-1.0 تعتبر مقايسة ممتازة ومناسبة لفحص20،21.
    5. وتؤكد أن siRNA مكافحة الفيروسات السلبية ليس له أي تأثير على فيروس النسخ المتماثل بمقارنته الآبار ترانسفيكتيد وغير المعالجة صورية. من الضروري غالباً لاختبار عناصر سلبية متعددة كبعض siRNA سلبية يمكن أن تؤثر عناصر التحكم في النسخ المتماثل الفيروس.
  3. التحقق النهائي من مقايسة الفرز الفائق
    1. كرر الخطوتين 1.2.1 و 1.2.2 أعلاه، ولكن هذا الوقت تصيب الخلايا فقط مع موي الأمثل. بدلاً من تصوير حية، إصلاح ووصمة عار اللوحة (كما هو موضح في 1-1-5 و1-1-6) في أفضل وقت نقطة (انظر 1.2.4).
    2. صورة اللوحة. تحليل النتائج باستخدام البرنامج النصي نفسه الذي سيتم استخدامه للشاشة (انظر 1.1.7 و 1.2.4). تأكيد الشروط تعداء (أي جيدة ضربة قاضية في آبار transfected مع التحكم تعداء الإيجابية وسمية الحد الأدنى في آبار transfected مع التحكم تعداء السلبية). تقدير Z-عامل لتحديد مدى متانة التحليل (انظر 1.2.4).
  4. إجراء المزيد من التجارب واعتبارات لإجراء الفرز الفائق
    1. اختبار متانة لوحات microtiter قد الكراك بعض لوحات أثناء الطرد المركزي، لا سيما عندما يتم الاحتفاظ الأغطية على وهي فصل لوحات متعددة في وقت واحد. للحد من تكسير، الطرد المركزي دون الأغطية (قدمت اللوحات بالأختام)، أو إنقاص عدد اللوحات تثفيل كل دلو.
    2. اختبار استقرار خليط كاشف تعداء على مر الزمن. حالما تتم إضافة الكاشف تعداء إلى اللوحات، قد يكون هناك تأخير كبير قبل إضافة الخلايا؛ ولذلك، من المهم أن تعرف الفترة الزمنية التي ستظل خليط كاشف تعداء فعالة. على الشاشة، قد يكون من الضروري إعداد الخلايا قبل إضافة خليط كاشف تعداء إلى اللوحات.
    3. التحضير لاستخدام موزع السائلة. تحديد وحدات التخزين اللازمة للاستغناء عن كاشف تعداء، والخلايا، والفيروسات، وإصلاح آخذا في الاعتبار حجم أن يحمل الأنابيب، الحجم فقدت قبل الاستغناء عن (إذا كان للوحدة هذه الميزة)، وحجم المتبقية المطلوبة في زجاجات تستخدم الاستغناء عن.
      1. وضع واختبار البرامج التي سيتم استخدامها للاستغناء عن كاشف تعداء الخلايا والفيروسات. لتقليل خسائر كاشف تعداء، الحد، إذا كان ذلك ممكناً، العدد سلفا يوزع. وضع بروتوكول لمعايرة موزع السائلة، والاختبار، والدقة.
    4. إعداد للاستغناء عن معظم كاشف تعداء والخلايا والفيروسات
      1. أولاً تحديد عدد اللوحات بحيث تتم معالجتها في دفعة واحدة نظراً لعدد لوحات خلايا التي يمكن عمليا أن يكون تريبسينيزيد في وقت واحد، وفصل عدد لوحات ميكروتيتير التي يمكن أن تكون مرة واحدة، طول الوقت اللازم لتجهيز دفعة واحدة من لوحات مع موزع السائلة، وكذلك الوقت اللازم للتصوير. ملاحظة: عموما، تجهيز لوحات 30 تقريبا في وقت واحد مجد للغاية وتجهيز دفعات 3 لوحات التحكم في يوم واحد.
      2. تحقق من حجم الكاشف تعداء اللازمة لعملية دفعة واحدة من لوحات تجريبيا. الاختبار أن هذا الحجم كاف بالاستغناء عن ميكروليتر 5 من الماء المقطر عدة مرات عبر لوح واحد يعادل عدد المرات التي ستكون مطلوبة للعملية دفعة واحدة.
      3. لضمان التوزيع العادل للخلايا، تقدير الوقت اللازم للاستغناء عن الخلايا عبر دفعة واحدة من لوحات. تحضير زجاجة تحتوي على حجم الخلايا المطلوبة لدفعة، والاستغناء عن الخلايا في أعمدة متعددة للوحة في وقت واحد، وعلى فترات منتظمة على مدى نفس الوقت سوف يستغرق للاستغناء عن عبر مجموعة لوحات. اختبار كم سيكون الضرورية لخلط الخلايا للاحتفاظ توزيع المتساوي للخلايا.
      4. لضمان التوزيع حتى للفيروس، كرر نفس الإجراءات أعلاه (انظر 1.4.4.3)، ولكن هذه المرة الاستغناء عن الفيروسات على الآبار المتلاقية. إذا كان الفيروس لا توزع بالتساوي، النظر في إعداد الفيروس في الأنابيب المخروطية وفورتيكسينج كل أنبوبة قبل صرفها.
    5. تتبع نمو الخلايا لتحديد الفترة الزمنية لنمو خلايا كافية للشاشة. كما أن تحديد متوسط عدد الخلايا التي يمكن أن تحصد كل لوح خلايا تنمو في مرحلة تسجيل لكي تتمكن من تقدير العدد المطلوب للشاشة.
  5. خطوات التحضير النهائي للفرز الفائق
    1. تصل إلى شهر واحد قبل بدء الفحص، تحديد جميع المواد اللازمة للشاشة. ترتيب أي الكواشف المطلوبة (انظر المواد). تأمين المبلغ المطلوب للفيروس من ناحية (ويفضل استخدام نفس الرصيد الذي تم استخدامه أثناء الأمثل.).
    2. تصل إلى أسبوعين قبل بدء الفرز، ذوبان الجليد ويكبر الخلايا المطلوبة للشاشة. ضمان توافر أجهزة الطرد المركزي ودلاء مربعا أجهزة الطرد المركزي.
    3. خلال الأسبوع الذي يسبق بدء الفرز، إعداد زجاجات وسائل الإعلام لعكس تعداء والعدوى، بمخزون إيثانول 70 ٪، تعداء X 2 كاشف مخفف (مثلاً 2 X غروب-الفنزويلية)، إذا كان اللازمة (مثلاً إذا كانت المكتبة siRNA هو المخفف في رناسيفري المياه، واحد سوف تحتاج إلى استخدام 2 X ترانسفيكت الخلايا)، ومختبرين للفيروس (واحد لكل مجموعة لوحات). التحقق من حالة الخلايا.
      1. إعداد حل أسهم من وصمة هويشت 33342 (مثلاً 5 ملغ/مل). إعداد لوحة توازن إذا كان أحد سوف تكون مطلوبة من أجل سينتريفوجينج.
      2. تأمين لوحة الغسالة في حالة عمل جيدة إذا كان سيتم استخدامه. ضمان موزع السائل معايرة بشكل صحيح والاستغناء عن الدقة والتحديد. أيضا، تأكد من البرامج التي يتم تعيين بشكل صحيح على موزع السائلة.

2-إجراء الشاشة الأولية عالية الإنتاجية

ملاحظة: قبل البدء في الشاشة [رني]، لوحات ميكروتيتير (مثل لوحات 384-جيدا) يلزم أن صفت مع مكتبة siRNA وفحص عناصر التحكم. الخطوات التالية هي أفضل أجرتها شخصين مع شخص واحد (أي شخص أ) يجري المسؤولة أساسا عن الاستغناء عن كاشف تعداء والخلايا عبر اللوحات، ويجري الشخص الثاني (أي شخص ب) المسؤولة عن سينتريفوجينج لوحات فورا قبل تعداء وإعداد الخلايا. بين قوسين هي بعض التفاصيل لتجهيز دفعة واحدة من لوحات 33 (أي نصف المكتبة) مع خط الخلية 786-O.

  1. إعداد لعكس تعداء
    1. الشخص ألف: وضع ما يكفي من وسائل الإعلام، التربسين وبرنامج تلفزيوني اللازمة للعملية دفعة واحدة من لوحات في حمام مائي 37 درجة مئوية. اختياري: تريبسينيزي صفيحة خلايا، وحساب عدد الخلايا للوحة الواحدة بغية تقديم تقدير في الوقت الحقيقي لعدد اللوحات المطلوبة كل دفعة.
    2. الحصول على دفعة لوحات (مثلاً 33 اللوحات) من الثلاجة وانتظر 20-30 دقيقة للسماح باللوحات إذابة الثلج. بينما يتم إزالة الجليد اللوحات، تابع مع الخطوات التالية.
      1. الشخص ألف: بيبيت إلى 50 مل مخروطية أنابيب مبلغ تعداء كاشف مخفف اللازمة لتجهيز دفعة واحدة من لوحات (مثل مل 2 × 37.125) ووضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية. ملء زجاجتين مع 70% إيثانول (مثل زجاجات 250-500 مل). شغل اثنان من أنابيب مخروطية 50 مل مع برنامج تلفزيوني وواحدة مع الماء المقطر.
      2. الشخص ألف: تزج موزع السائلة الأنابيب في زجاجة الإيثانول 70%. إذا لن يتم استخدام كل من النصائح للاستغناء عن الكاشف تعداء (مثلاً إذا لم يتم استخدام الآبار الخارجي اللوحة)، فصل الأنابيب لا لزوم لها أولاً. ضع قطعة من إخفاء الشريط حول الأنابيب وضع علامة على هذه النقطة أدناه والتي يمكن أن تعتبر في الأنابيب معقمة. رئيس الوزراء مع حوالي 25 مل. صب الإيثانول إضافية في زجاجة لاستبدال وحدة التخزين المفقودة. الأنابيب واسمحوا الجلوس في الإيثانول لمدة 5 دقائق على الأقل.
      3. الشخص باء: التحضير تريبسينيزي الخلايا. رذاذ هود زراعة الأنسجة (TC) مع الإيثانول 70%. رذاذ ويوضع بيبيتس اللازمة والنصائح، والزجاجات و [ميكروفوج] أنابيب لإعداد الخلايا في هود (انظر 2.2.1.1 و 2.2.1.2). الطرد المركزي لوحات مختومة في مجموعات في غ س 1026 لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الأغطية من اللوحات في غطاء TC، إذا قرر سابقا أن اللوحات قد صدع أثناء الطرد المركزي عندما يتم الاحتفاظ الأغطية على (انظر 1.4.1).
    3. الشخص ألف: إزالة الأختام من اللوحات. قبل أو أثناء أو بعد الأختام قد أزيلت (تبعاً لطول مدة الحضانة المطلوبة)، بيبيت المبلغ المطلوب من تعداء كاشف (مثلاً 375 ميكروليتر/أنبوب لتركيز 0.05 ميكروليتر رنيم/بئر نهائية) في أنابيب مخروطية تتضمن مخفف كاشف تعداء المعالجون مسبقاً (مثلاً 37.125 مل/أنبوب).
    4. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 مرات. احتضان في درجة حرارة الغرفة للوقت المحدد للكاشف تعداء قيد الاستخدام (مثل 0-10 دقيقة).
  2. عكس تعداء
    1. وقد "ب الشخص" إكمال المهام التالية.
      1. تبدأ تريبسينيزينج الخلايا (مثل 3 ألواح الخلايا 786-O). نضح وسائط الإعلام من كل لوحة. شطف مع مل 9 من برنامج تلفزيوني. بيبيت 3 مل التربسين للوحة الواحدة. احتضان في 37 درجة مئوية لحوالي 5 دقيقة ريسوسبيند الخلايا مع مل 22 من وسائل الإعلام. بيبيت صعودا وهبوطاً 10 مرات.
      2. الجمع بين تعليق خلية من كل لوحة زراعة الأنسجة في زجاجة معقمة. مزيج من تعليق خلية بالعكس. بيبيت مختبرين 1 مل من تعليق خلية في اثنان منفصلة [ميكروفوج] أنابيب. إزالة عينة من كل [ميكروفوج] أنابيب وحساب الخلايا. حساب حجم تعليق الخلية المطلوبة للكثافة المطلوبة (مثلاً 1500 بئر/الخلايا)، وإعداد ما يكفي تعليق خلية المخفف (مثلاً 500 مل) الاستغناء عن عبر دفعة واحدة من لوحات.
    2. وقد ألف شخص بإكمال المهام التالية بالتوازي مع "الشخص باء"
      1. إفراغ السائل موزع أنابيب من الإيثانول. رئيس الوزراء الأنبوب مع حوالي 25 مل من برنامج تلفزيوني، ثم قم بإفراغ الأنبوب. كن حذراً عند التعامل مع الأنابيب التأكد من أن الجزء الأنابيب أدناه إخفاء الشريط الذي سوف تكون مغمورة في الكاشف تعداء وتظل عقيمة لاحقاً في تعليق خلية. تفصل الصفائح التي يمكن أن يتم بأمان مع أنبوب مخروطي واحد من تعداء كاشف الحل.
      2. بيبيت الحلول كاشف تعداء أعلى وأسفل 10 مرات. رئيس الوزراء الأنبوب مع الحل كاشف تعداء. لتقليل خسائر كاشف تعداء، رئيس الوزراء بحل ما يكفي الكاد مسح النصائح. حدد البرنامج الصحيح على موزع السائلة والاستغناء عن 5 ميكروليتر من تعداء كاشف كل بئر.
        تنبيه: ترصد عن كثب مستوى الكاشف تعداء حيث أن ذلك هو تجديد قبل أن يفوت. الإنجاز اللوحات التي مجموعة وبصرف النظر ينبغي أن توفر تلميحاً إضافة مزيد من حل الكاشف تعداء.
      3. الطرد المركزي اللوحات في 1026 x ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. هذه المرة سوف تكون الأغطية، حيث قد يكون من الضروري الطرد المركزي لوحات أقل في وقت واحد لمنع تكسير (مثل 2 لوحات كل دلو). احتضان اللوحات في درجة حرارة الغرفة للوقت المحدد للكاشف تعداء قيد الاستخدام (مثل 10-20 دقيقة).
      4. أثناء الاحتضان، إفراغ الأنبوب الحل كاشف تعداء، ووضعه في أنبوب مخروطي كامل 50 مل يحتوي على برنامج تلفزيوني. شطف الأنبوب مع حوالي 25 مل من برنامج تلفزيوني فتيلة وإفراغ.
        1. إذا كان أكثر من النصائح ذاهبون لاستخدامها للاستغناء عن الخلايا مما كانت تستخدم للاستغناء عن كاشف تعداء، إعادة إرفاق الأنابيب غير مستخدمة، وإعادة تعقيم جميع الأنابيب مع الإيثانول 70% قبل الشطف الأنبوب مع برنامج تلفزيوني (انظر 2.1.2.2).
      5. مزيج من الزجاجة التي تحتوي على تعليق خلية مرة واحدة وقد تم إعداده. ضع الأنابيب في تعليق خلية، ورئيس الوزراء ما يكفي لمعرفة أن يتم الاستغناء عن كل نصيحة بشكل صحيح. الاستغناء عن 30 ميكروليتر كل بئر تعليق خلية عبر جميع لوحات. إذا لزم الأمر، مزيج من تعليق خلية في فترات منتظمة لتجنب تسوية.
        تنبيه: في بعض الأحيان قد عصا قطرات تعليق الذي يحتوي على وسائط الإعلام للجانبين من النصائح. عندما يلاحظ هذا، نضح في أقرب وقت ممكن أو مسح بواسطة أنسجة خالية من الوبر صب في الإيثانول 70%.
      6. إفراغ الأنبوب تعليق خلية. شطف الأنبوب مع حوالي 25 مل من برنامج تلفزيوني، تليها حوالي 50 مل ماء المقطر.
    3. السماح لوحات للجلوس لمدة 45-60 دقيقة من الوقت خلية البذر في درجة حرارة الغرفة قبل أن تعود اللوحات للحاضنة. احتضان اللوحات في حاضنة دون عائق للطول المطلوب للجينات إسكات (مثلاً ح 48) (انظر 1.1.4.5).
  3. العدوى
    1. لتوفير الوقت، اليوم قبل إصابة الخلايا، وزجاجات بيبيت إلى العقيمة المبلغ الدقيق للوسائط المطلوبة لتصيب كل دفعة من لوحات بما في ذلك وسائط الإعلام للآبار غير مصاب (مثل 2 × 350 مل و 2 × 50 مل لوحات 33). وبالإضافة إلى ذلك، اختبار موزع السائلة للضبط والدقة، وإعادة معايرة إذا لزم الأمر.
    2. الحارة وسائط الإعلام على 37 درجة مئوية. ملء زجاجتين مع الإيثانول 70%، واثنين من أنابيب مخروطية 50 مل مع برنامج تلفزيوني، وواحدة مع الماء المقطر. تحقق من أجهزة الطرد المركزي عند درجة حرارة الغرفة.
    3. تعقيم الأنابيب مع الإيثانول 70%، وشطف مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح سابقا (انظر 2.1.2.2 و 2.2.2.1). بينما الأنبوب يجلس في الإيثانول، بيبيت حجم الدقيق للفيروسات المطلوبة في زجاجة تحتوي على وسائط الإعلام سابقا استعداد للعدوى (انظر 2.3.1). شطف الأنبوب مع برنامج تلفزيوني فتيلة مع 25 مل وثم إفراغ.
    4. إزالة اللوحات من الحاضنة ووضعها في غطاء TC. رئيس الوزراء الأنبوب مع وسائل الإعلام. الاستغناء عن 40 ميكروليتر من وسائل الإعلام في آبار مراقبة غير مصاب. إفراغ الأنبوب لوسائط الإعلام وشطف مع 25 مل برنامج تلفزيوني. (انظر 2.2.2.5 لتنبيه)
    5. بعد خلط الفيروس، وضع الأنابيب في زجاجة تحتوي على الفيروس. الاستغناء عن 40 ميكروليتر من الفيروسات عبر اللوحات. الطرد المركزي لوحات لمدة 30 دقيقة في 400 غرام x في درجة حرارة الغرفة. العودة اللوحات للحاضنة. احتضان اللوحات لطول الفترة الزمنية (مثلاً ح 24) سبق تحديدها (انظر 1.2.4).
  4. تحديد، وتلطيخ الخلايا
    1. توفيرا للوقت، في اليوم السابق لتحديد، تحضير زجاجة من إصلاح وتلطيخ محلول يحتوي على الفورمالديهايد، وبرنامج تلفزيوني (مثل مل 179 من 37% فورمالدهيد ومل 270 من برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي من 4% فورمالدهايد) لكل دفعة من اللوحات، ولكن تجاهل هويشت وصمة عار. تخزين في الاشتعال مجلس الوزراء بعيداً عن الضوء.
    2. شطف الأنبوب مع الإيثانول 70% وبرنامج تلفزيوني كما هو موضح سابقا (انظر 2.1.2.2 و 2.2.2.1). إضافة حجم هويشت المطلوبة (على سبيل المثال. 2.5 مل من 5 ملغ/مل هويشت لتركيز نهائي في البئر 7.5 ميكروغرام/مل) لتحديد وتلطيخ الحل ومزيج.
    3. الاستغناء عن 30 ميكروليتر من تحديد وتلطيخ الحل عبر جميع لوحات. وضع اللوحات في الحاضنة لمدة 30 دقيقة. وبعد الحضانة، تطبيق الأختام على اللوحات وتخزين اللوحات في 4 درجات مئوية محمية من الضوء. غسل الأطباق إذا لزم الأمر (انظر 1.1.6).
  5. تصوير وتحليل الصور
    1. صورة اللوحات مع مجهر الآلي، وارتفاع محتوى. استخدام إعدادات محددة مسبقاً، ولكن أول اختبار الإعدادات للتأكد من إدخال أي تعديلات بحاجة إلى بذل.
    2. التحديد الكمي التجارة والنقل (أو أخرى مراسل الفلورسنت) ومنطقة هويشت الواحدة وكذلك باستخدام البرنامج النصي السابق المتقدمة (انظر 1.3.2). اختبار البرنامج النصي مع حفنة من لوحات أولاً لتحديد إذا كان أي تعديلات طفيفة تحتاج إلى قبل دفعة تحليل جميع اللوحات.
    3. تحديد عدد الزيارات. ملاحظة: الأسلوب Z-نقاط/جنون (متوسط الانحراف المطلق) قوية هو أسلوب الذي يستخدم عادة في تحقيق هذه الغاية. بشكل عام، عشرات > 2 أو <-2 تم تعيينها كانقطاع. يتم استخدام هذه الطريقة أفضل عندما تكون موزعة بشكل عشوائي عبر اللوحات عينات siRNA وليس، على سبيل المثال، مجمعة حسب وظيفة حسب العينات التي تستخدم كعناصر تحكم السلبية الفعلية . تصفية سيرناس السامة للخلايا كهذه سيكون من المتوقع أن الانخفاض غير تحديداً الفيروس ينتشر (انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل عن تصفية يضرب السامة للخلايا).

3-التحقق من صحة الشاشة ثانوية مرات مع مكتبة شرنا لجنة الحقيقة والمصالحة (اتحاد [رني])

ملاحظة: انظر المناقشة للحصول على تفاصيل حول تحديد مرات للتحقق الثانوي وإمكانية فحص التكنولوجيات. إذا تم تحديد التكنولوجيا siRNA للتحقق من صحة الثانوية، يمكن استخدام بروتوكول التنمية والتحقق من صحة المقايسة نفسه كما كان يستخدم للشاشة الرئيسية (انظر 1).

  1. الحصول على مكتبة شرنا لجنة الحقيقة والمصالحة مخصصة استهداف الجينات المرشحة للفائدة كمخزون الجلسرين.
  2. إعداد تعداء نوعية بلازميد الحمض النووي من مخزونات والغليسيرول. ملاحظة: بروتوكول مفصل (أي "شرنا/سجرنا/ORF والغليسيرول وإعداد بلازميد الحمض النووي") يمكن الاطلاع على هنا: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  3. إنتاج lentiviruses الإعراب عن شرنا استهداف جينات الفائدة مع والبلازميدات الحمض النووي. ملاحظة: بروتوكول مفصلة لإنتاج لينتيفيروس في لوحات 96-بئر [أي "شرنا/سجرنا/ORF إنتاجية عالية الإنتاج الفيروسية (96 جيدا)"] يمكن الاطلاع هنا: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  4. تصيب الخلايا التي تحتوي لينتيفيروسيس. ملاحظة: بروتوكول مفصل للإصابة لينتيفيرال في لوحات 96-جيدا (أي "الإصابة لينتيفيرال") متاحة على الإنترنت في http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
  5. تصيب الخلايا بفيروس أونكوليتيك أما التحديد بوروميسين التالية (انظر 3.4 للبروتوكول الاختيار) من الخلايا ترانسدوسيد بنجاح أو توصيل التالية مباشرة (بدون تحديد بوروميسين). لتحديد كمية الفيروس الأمثل ومدة حضانة الفيروس، استخدم نفس الطريقة المستخدمة للشاشة الرئيسية.

4-التعليم العالي التحقق من الصحة

ملاحظة: الغرض من التحقق من التعليم العالي أساسا تأكيد أن الضرب الهدف، ورم معين، ويعزز فعالية المجراة في. اختبار واحد يمكن أيضا عما إذا كان ينظم انتشار عبر طيف خطوط الخلايا السرطانية

  1. تأكيد أن ضربة قاضية للجينات المرشحة على الهدف
    1. أولاً التأكد من أن هناك علاقة بين النمط الظاهري وإسكات الجينات. استخدام التحليل نفسه تم تطويره للشاشة أو تعديله لصيغة 6-جيدا لتقييم تعزيز أو إعاقة انتشار المرض بشكل أكبر. إجراء دورة وقت مع خلايا transfected مع siRNA استهداف gene(s) اهتمام زائد وناقص الفيروس.
    2. صورة الآبار التي تحتوي على الخلايا المصابة بالفيروس، وجمع ليساتيس الخلية من الآبار غير مصاب في فترات زمنية منتظمة. تحديد ما إذا كان هناك ارتباط بين إسكات الجينات وتعزيز أو إعاقة انتشار. تقييم إسكات الجينات "الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل" (qPCR) و/أو النشاف الغربية.
    3. إجراء تجربة إنقاذ وراثية للتأكد من الضرب على الهدف. ملاحظة: في تجربة إنقاذ نموذجية، الجينات المرشحة هي طرقت إلى أسفل مع [رني] بينما في الوقت نفسه هي transfected خلايا عابر مع كدنا مقاومة [رني] (مثلاً أورثولوج من الجينات) التعبير عن الجينات المرشحة لتحديد ما إذا كان استعادة النمط الظاهري الجينات أو "إنقاذ". يمكن أيضا أن تستخدم خطوط الخلايا مستقرة overexpressing كدنا مقاومة [رني] من الجينات المرشحة للفائدة.
    4. بدلاً من ذلك، بدلاً من تجربة إنقاذ وراثية، استخدام فحوصات المتعامدة متعددة للتأكد من أن الضرب على الهدف [مثل تحديد ما إذا كان يتم الحصول على النمط الظاهري نفسه عند ضربة قاضية للجينات المستهدفة مع سيرناس متعددة، عند ضربة قاضية ل الجينات المستهدفة في عدة أسطر الخلية مستقر معربا عن شرنا ضد الجينات المستهدفة، وعند خروج المغلوب مع كريسبر (متفاوت المسافات بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب تكرار)-التكنولوجيا Cas9 في خطوط الخلايا متعددة.].
  2. تأكيد أن الضرب ورم على حدة وينظم انتشار عبر مجموعة من خطوط الخلايا السرطانية
    1. القيام مقايسة مماثلة كما هو الحال في 4.1.1، لكن مع الخلايا الطبيعية فضلا عن أخرى خطوط الخلايا السرطانية.
  3. تأكيد أن التلاعب بالجينات مرشحة يعزز فعالية في فيفو
    ملاحظة: هو موضح أدناه ثلاثة طرق ممكنة للتلاعب الجينات المستهدفة في فيفو.
    1. العثور المخدرات للتلاعب بالجينات المستهدفة. إذا كان هناك دواء مثل مثبط جزيء صغيرة التي تستهدف نفس الجين، إدارة مع فيروس أونكوليتيك في فيفو. من المهم تحديد التوقيت الأمثل لإدارة المخدرات.
    2. مهندس الفيروس لتمنع أو أوفيريكسبريس الهدف الجينات اعتماداً على ما إذا كان أحد يرغب أن تعوق أو تعزز الهدف الجينات. لكبح الجين، مهندس الفيروس أونكوليتيك للتعبير عن مهيمن سلبية من الجينات أو للتعبير عن شرنا استهداف الجينات. تعزيز التعبير عن الهدف الجينات، استنساخ الفيروس أونكوليتيك مع التحوير overexpressing الجينات.
    3. مهندس خطوط الخلايا مع الجين طرقت إلى أسفل أو من طرقت استخدام شرنا أو التكنولوجيا كريسبر-Cas9، على التوالي. زرع خط الخلية هندسيا والبرية-النوع الخلية خط في فيفو وبعد ذلك تصيب بفيروس أونكوليتيك. ملاحظة: هذا الأسلوب بمثابة دليل لمبدأ ويمكن أن تساعد في تحديد ما إذا كان استثمار المزيد من الوقت والموارد لتطوير دواء للتلاعب الجينات في فيفو، على سبيل المثال، سيكون من المفيد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد في الشكل 1لمحة عامة عن سير العمل لتحديد أهداف المضيف لتعزيز العلاج فيروس أونكوليتيك.

كما هو موضح في الشكل 1، هو الخطوة الأولى الحاسمة لإجراء شاشة [رني] الفائق التنمية المقايسة. يوفر الشكل 2A تخطيط لوحة عينة للفحص الأمثل تعداء. الشكل 2B يتكون من صور الممثل للنتائج المتوقعة، و الشكل 2 قطعة تمثيلية من النتائج المتوقعة. وعقب ضربة قاضية siRNA PLK-1 وجين الذي يؤدي إلى موت الخلية، ويمكن استخدامها كعنصر إيجابي لرصد كفاءة siRNA ضربة قاضية، للمرء أن يتوقع بقاء الخلية لتكون بين 0 30%، إلا إذا كان لخط خلية طويلة مضاعفة الوقت في هذه الحالة سوف يستغرق l أونجير لمراقبة النمط الظاهري موت الخلية. كما ينبغي أن siRNA عدم استهداف الحد الأدنى السامة للخلايا مع بقاء نسبية مماثلة لتلك الخلايا غير المعالجة.

عنصر رئيسي آخر لتطوير التحليل لتحديد وزارة الداخلية التي تصيب الخلايا وطول الفترة الزمنية للإصابة. ويوفر الشكل 3A تخطيط لوحة عينة لتحديد كمية الفيروس ومدة حضانة الفيروس. ويصور الشكل 3B نتائج دورة الوقت يعيش 786-O الخلايا المصابة مع ففد-اجفب (أونكوليتيك فيروس اللقاحية معربا عن تعزيز التجارة والنقل مع الجينات Thymidine كيناز وعامل النمو اللقاحية حذف) في أشهر مختلفة. صور الممثل للخلايا المصابة مع اجفب ففد في وزارة الداخلية 0.05 مبينة في الشكل 3. استناداً إلى النتائج المرسومة في الشكل 3B، واحد قد حدد موي 0.05 وطول من عدوى ح 21 وهذا سيسمح للكشف عن الزيادة والنقصان في انتشار هذا الوقت-النقطة موجودة ضمن مجموعة خطي، وما يقدر Z-العامل في منظمة الشفافية الدولية هذا لي نقطة هو 0.6 للافواج التي تزيد والأفواج التي تقلل انتشار. وكجزء من التحقق من صحة هذا التحليل، واحدة تريد إصلاح الخلايا في هذا موي والنقطة الزمنية، وحساب Z-العامل.

في أعقاب البروتوكول وصف، أجرينا على نطاق الجينوم [رني] شاشات عبر ثلاثة خطوط الخلايا الورم مختلفة (مثل واوفسار-8، U373، NCI-H226) في تكرار مع مكتبة siRNA استهداف جينات 18,12015. استخدام أسلوب جنون، حددنا 1008 عدد الزيارات المشتركة على الأقل 2 من خطوط خلايا السرطان 3 (الشكل 4 أ). وكشف تحليل المسار مرات حددت في الشاشات الإثراء لأعضاء للاستعراض الدوري الشامل (البروتين تكشفت استجابة) وأراد (تدهور البروتين المرتبطين بها الشبكة اندوبلاسميك) مسارات (الشكل 4 أ). اخترنا 10 مرات داخل هذه المسارات للثانوي التحقق من الصحة باستخدام siRNA مع تسلسل استهداف مختلفة عن تلك الخاصة بالشاشة الرئيسية (الشكل 4 باء). وكجزء من التحقق من التعليم العالي، وقد أجرينا تجربة إنقاذ وراثية مع IRE1α و ATF6α (تفعيل النسخ عامل 6 ألفا) للتأكد من أن هذه الزيارات كانت في الهدف (الشكل 4).

Figure 1
رقم 1: التخطيطي لسير العمل لتحديد أهداف المضيف لتعزيز العلاج فيروس أونكوليتيك- الخطوة الأولى هي وضع والتحقق من صحة مقايسة للفرز [رني] الفائق، الذي يشمل تحسين ظروف تعداء لإدخال siRNA في الخلايا، وتحديد مقدار الأمثل للفيروس (أي وزارة الداخلية) لتصيب الخلايا مع مدة حضانة الفيروس. والخطوة الثانية القيام شاشة على نطاق الجينوم الفائق. مكتبة siRNA استهداف الجينات عبر كامل الجينوم هو صفت على لوحات ميكروتيتير. الخلايا ثم عكس transfected مع مكتبة siRNA. وبعد فترة حضانة 48-72 ح للسماح لإسكات الجينات، مصابون بالخلايا المثلى كمية الفيروس. بعد الطول الأمثل لاحتضان الفيروس، إصلاح الخلايا والملون، ولاحقا تصويرها مجهر عالية المحتوى. تحليل الصور والبيانات اللاحقة سوف تساعد على تحديد الجينات التي تعدل إلى حد كبير النسخ المتماثل الفيروس، التي يشار إليها باسم "يضرب". شاشة التحقق ثانوي تتم على تحديد عدد الزيارات من الشاشة الرئيسية عموما استخدام siRNA أو شرنا مع مناطق مختلفة من البذور. وتجري تجارب التحقق من التعليم العالي للتأكد من أن يضرب على الهدف، ورم محددة وتعزيز فعاليتها في فيفو. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: شروط الاستفادة المثلى تعداء الفائق [رني] فحص المقايسة. (أ) تخطيط لوحة عينة لتحسين ظروف تعداء مع اثنين من خطوط الخلايا المختلفة. (ب) صور الممثل 786-O الخلايا (1500 الخلايا أيضا) ملطخة هويشت 33342 بعد 72 حضانة ح تعداء كاشف مخفف وحدها (أي غير المعالجة)، مع كاشف تعداء ومخفف (أي موك ترانسفيكتيد)، مع عدم استهداف siRNA و siRNA استهداف PLK-1. (ج) نتائج الممثل من تعداء الأمثل التجربة تبين بقاء 22% من الخلايا transfected مع siRNA PLK-1 (ن = 24) وبقاء 94% من الخلايا transfected مع عدم استهداف siRNA (n = 8). أشرطة الخطأ = ± SD، الانحراف المعياري؛ تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تحديد كمية الفيروس ومدة حضانة الفيروس للمقايسة الفحص [رني] الفائق. (أ) نموذج لوحة تخطيط للاستفادة المثلى من كمية الفيروس ومدة حضانة الفيروس. عناصر الأعمدة 1 و 24 تحتوي على تعداء وهي ترك وقاية. تحتوي الأعمدة 2 إلى 23 على الخلايا غير المعالجة وصورية transfected الخلايا والخلايا transfected مع عناصر تحكم الفيروسات الإيجابية والسلبية كل مصاب بمجموعة من أشهر بدءاً من عدم وجود فيروس في أعمدة 2 و 3. وكانت الزنزانات 786-O (ب) عكس transfected مع عدم استهداف siRNA والمحتضنة ح 48. وفي وقت لاحق أنهم كانوا مصابين ففد-التجارة والنقل في أشهر أوضح وتصويرها على فترات ح 8 ابتداء من 5 ساعات ما بعد الإصابة (hpi). مجال التجارة والنقل يعني كل بئر (± SD) تم حسابها لكل نقطة الوقت (n = 12) ورسمها على الرسم البياني. Z-عامل حساب بين النقطتين أ وب 0.6 والمحسوب بين النقطتين ب وج Z-العامل 0.6. (ج) أشارت إلى الممثل صوراً حية من بئر المصابة مع موي 0.05 في الوقت النقاط. التكبير، x 10؛ 9 حقول/جيدا؛ تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: يحدد الشاشة على نطاق الجينوم ER الإجهاد استجابة الحصار كمحسس قوية لوساطة رهابدوفيروس أونكوليسيس. (أ) رسم تخطيطي متداخل تحدد عدد مرات متداخلة من الفائق [رني] شاشات في 3 خطوط الخلايا السرطانية، وجدول (+ الاصطناعية الفتاكة؛-، أي تفاعل) ويوضح الرسم التخطيطي (يضرب الأحمر المبين في) يضرب الرئيسية في الاستعراض الدوري الشامل وأراد المسارات. (ب) حددت المفوضية الأوروبية50 التحولات (أشرطة سوداء، ترك المحور y) للخلايا U373 تعامل مع مارابا الفيروس (48 ساعة) بعد العلاج مع siRNA (ح 72) تستهدف سلسلة من الزيارات الاستعراض الدوري الشامل/أراد من الشاشة. ويرد التعبير مرناً النسبي لكل الجينات عقب siRNA ضربة قاضية (ح 72) في الأبيض (محور ص الحق). (ج) أجريت فحوصات سلامة خلية 48 ساعة بعد الإصابة بعدوى الفيروس مارابا، في U373 الماوس الخلايا معربا عن اكتوبيكالي ATF6α (أو مراقبة التجارة والنقل) siRNA ± تستهدف البشرية ATF6α (أو عدم استهداف [NT] التحكم؛ وترك الفريق) أو XBP1(s) البشرية (أو عنصر تحكم ) siRNA ± تستهدف البشرية IRE1α (أو مراقبة؛ وحق الفريق). تظهر البقع الغربية مما يدل على إسكات الجينات والتعبير الجيني حمل خارج الرحم. تحولات المفوضية الأوروبية50 = التحول في الجرعة اللازمة لقتل 50% الخلايا؛ الفيروسات أشرطة الخطأ = ±SD؛ XBP1(s) = إكس بوكس البروتين 1 (تقسم)؛ أجريت في (ب)، ANOVAs اتجاه واحد متبوعاً بونفيروني الاختبار متعددة مقارنة المخصص بعد استخلاص قيم p؛ في (ج)، t-الاختبارات الطالب أجريت لاشتقاق قيم p؛ * ف < 0.05؛ #p < 0.05. (تم تعديل هذا الرقم من ماهوني et al., 201115). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقدم هنا بروتوكولا لتوظيف الفرز الفائق [رني] لتحديد أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز العلاج فيروس أونكوليتيك. وهذا قد تم اختباره بنجاح مع أونكوليتيك مارابا فيروس وفيروس اللقاحية أونكوليتيك، ولكن، كما ذكر، فإنه يمكن تكييفها للاستخدام مع غيره من الفيروسات أونكوليتيك أو غيره من الفيروسات عموما تحديد الجينات المضيفة التي تعدل النسخ المتماثل الفيروس. بروتوكول الفحص يهدف أيضا تحديد الجينات التي تزيد أو تقلل انتشار، ولكن من الممكن تعديله سهولة لقراءات أخرى. شاشاتنا مع الفيروس مارابا، على سبيل المثال، صممت لتحديد الجينات تحوير أونكوليسيس الاستفادة مقايسة بسيطة صبغ حيوية على أساس ريسازورين نقاط بقاء الخلية (انظر الشكل 4)15. في هذه الشاشات، بعد الحضانة مع الفيروسات، بدلاً من تحديد الخلايا مع فورمالدهايد وتلطيخ مع هويشت، يمكننا الاستغناء عن صبغ ريسازورين في كل بئر (تركيز النهائي 20 ميكروغرام/مل)، وبعد حضانة 6 ح، قمنا بقياس امتصاص (573 nm) مع لوحة قارئ. ويمكن أيضا استخدمنا عدد الخلايا استناداً إلى تلطيخ هويشت كقراءات. بينما استخدام مراسل بديل لرصد فيروس النسخ المتماثل غير ضرورية في هذه الشاشة، يعيش فيروس مع بروتين مراسل، خاصة بروتين فلوري تسهيل التحسين الشاشة كما واحد يمكن، على سبيل المثال، مراقبة النسخ المتماثل الفيروس؛ وعلاوة على ذلك، فيروس مع بروتين مراسل أقل مرهقة ومكلفة من استخدام الأجسام المضادة لوصمة عار لمولدات المضادات الفيروسية، لكن من الممكن للشاشة دون واحد. وبالإضافة إلى ذلك، واحدة يمكن أن تجعل حتى المزيد من التعديلات للفحص للتحقيق المضيف من العوامل التي تؤثر على العدوى، وحجم الاندفاع، وحتى أكثر تفصيلاً تعمل الفرعية مثل موت الخلايا المناعية. في كل حالة، سيتبع أحد بروتوكول تنمية مقايسة مماثل، فحص استراتيجية وأساليب التحقق من الصحة على التعليم الثانوي والعالي.

في البروتوكول، فإننا نقترح الاستفادة المثلى من تعداء الظروف المثالية مع خطوط الخلايا السرطانية متعددة. وهناك على الأقل سببان للأمثل مع خطوط الخلايا متعددة. سبب واحد أن ليس كل خط الخلية قابلة للفرز الفائق بعض قد يكون من الصعب على ترانسفيكت أو قد لا تتقيد جيدا، ولكن هو سبب رئيسي تمكين الفرز مع خطوط الخلايا متعددة بغية تجنب التحيز المتأصلة في الخلية. اختيار خطوط الخلية يعتمد إلى حد كبير على أهداف واحدة. للتركيز على نوع معين من سرطان أو حدد أنواع السرطان المتباينة تشمل طائفة أوسع أن يختار واحدة. بدلاً من ذلك، واحد قد ترغب في التركيز على خطوط خلايا الورم التي مقاومة لتحديد العوامل المضيفة التي يمكن التلاعب بها لجعل خطوط الخلايا الورم أقل مقاومة للعدوى بفيروس أونكوليتيك.

بالإضافة إلى اختيار خطوط الخلايا، يتم اختيار عناصر إيجابية وأخرى سلبية فيروس أحد الاعتبارات هامة لأي شاشة. في بعض الحالات، قد لا يكون معروفا جينات الفيروس التي تلزم أو تقييد النسخ المتماثل، أو إذا كانت معروفة، قد تكون خلية على حدة. ونتيجة لذلك، واحد لا يزال تحديد متانة التقريبي والنطاق الديناميكي للفحص باستخدام عناصر تحكم مركب. على سبيل المثال، يمكن استخدام إحدى الخلايا مصابة أو الخلايا المصابة مع موي منخفضة كعنصر تحكم مركب إيجابية لتحديد الجينات أن انخفاض انتشار عند ضربة قاضية. لتحديد الجينات التي تعزز انتشار عند ضربة قاضية، واحد يمكن أن تصيب الخلايا مع سلسلة تخفيف من الفيروس، واستخدام الآبار مع إشارة الحد الأقصى كعنصر تحكم مركب إيجابية.

اختيار يضرب للتحقق من صحة الشاشة الثانوية، ونوع التكنولوجيا لتوظيف أمر آخر يتطلب مداولات متأنية. عموما يتم اختيار المرشحين للتحقق من صحة الشاشة الثانوية استناداً إلى حجم الضرب، على ما إذا كان أنها تعدل إلى حد كبير انتشار في خطوط خلايا السرطان متعددة (إذا كانت شاشات الأولية أجريت في العديد من خطوط الخلايا) وعلى الفائدة البيولوجية. يمكن أن تساعد أدوات المعلوماتية الحيوية مثل ديفيد،من2223والنمر24،25 من السلسلة وبيندب26 لعزل المسارات ويضرب ذات الأهمية البيولوجية. ميرسر et al. 8 وصف استخدام برمجيات تحليل الصورة المصدر المفتوح وقد أتاحت أيضا خوارزمية تقوم بأنها وضعت للتصور والتحليل مرات. عامل واحد تأخذ في الاعتبار عند تفسير النتائج هو أن إسكات الجينات قد آثاراً مختلفة تبعاً للمرحلة في دورة حياة الفيروس التي يجري التحقيق فيها. على سبيل المثال، من الممكن أن ضربة قاضية للجينات في بداية دورة الحياة قد تمنع النسخ المتماثل للفيروس، بينما ضربة قاضية في مرحلة لاحقة قد تزيد من النسخ المتماثل. وغالباً ما تجري الشاشات الثانوية مع siRNA من بائع مختلف مع مناطق مختلفة من البذور مع سيرناس متعددة للجينات. ومع ذلك، يمكن أن تستخدم تكنولوجيات التكميلي استهداف الجينات المرشحة مثل ناقلات كريسبر-Cas9 أو لينتيفيروس الإعراب عن شرنا.

أسلوب التحليل هو أيضا أحد الاعتبارات الهامة. نقترح هنا باستخدام Z-نقاط قوة أو اقترح جنون20،27 مع انقطاع للدعوة إلى ضرب > 2 أو <-2. ويمكن زيادة انقطاع أو إنقاصه اعتماداً على ما إذا كان يتم التركيز على القضاء على أكثر المغلوطة أو التقاط السلبيات الكاذبة أكثر. على سبيل المثال، في شاشة الفائق مؤخرا مع فيروس اللقاحية9، تم تعيين وقف انخفاض في-1.5 (لا انقطاع العليا وصفت كما جرى التركيز على تحديد الجينات التي انخفض انتشار عند ضربة قاضية). وهناك أيضا أساليب أخرى يمكن استخدامها بما في ذلك z-النقاط وصمد (فرق المتوسط الصارم الموحد)، و ب20،29،،من28درجة30. عربات يد et al.31 مقارنة قوائم ضرب المتولدة عن رتبة sum، جنون، الدرجة المعيارية وصمد والعثور على كل أسلوب التحليل أدت إلى ضرب قوائم مختلفة. بكاملها، لا توجد طريقة مثالية أو وقف إنتاج المواد الانشطارية. في نهاية المطاف، سوف يؤكد دراسات التحقق من التحقق من الصحة والتعليم العالي الشاشة الثانوية يضرب صحيحاً.

ويجب أيضا النظر في طريقة تصفية يضرب السامة للخلايا. طريقة واحدة إجراء شاشات الأولية في موازية زائد أو ناقص الفيروس. يسمح هذا الكشف عن سيرناس التي السامة للخلايا بمفردها. وكان هذا النهج الذي نتبعه في أعمالنا مارابا الفيروسات شاشات15؛ ومع ذلك، هذا ليس غالباً العملية. ربما هي طريقة أكثر عملية، بالإضافة إلى كونها قوية، للتأكد من عدد الزيارات التي السامة للخلايا كجزء من الثانوية شاشة التحقق من الصحة، خاصة إذا كان التركيز المرء تحديد مرات النسخ المتماثل النقصان عند ضربة قاضية. على سبيل المثال، في شاشة الابتدائي جينوم كله مع فيروس ميكسوما، جورج وآخرون. وحدد 11 سيرناس 1,588 أن تناقص النسخ المتماثل الفيروس عند ضربة قاضية. لتصفية سيرناس السامة للخلايا، أنها أجرت شاشة سيتوتوكسيسيتي ثانوي مع هذه سيرناس؛ وقاما بقياس صلاحية خلية ح 72 تعداء بعد استخدام مقايسة بقاء خلية على أساس ريسازورين. وحددت سيرناس السامة للخلايا استناداً إلى Z-نقاط ≤-1.96. وثمة نهج آخر ببساطة تصفية سيرناس السامة للخلايا من البيانات الفرز الأولية استناداً إلى خفض عدد الخلايا بنسبة مئوية معينة، على سبيل المثال، خفض > 50% كما هو الحال في سيفان et al. 9، أو استناداً إلى نقاط معينة كما هو الحال في لي et al. 14؛ في دراستهم للمضيف العوامل المطلوبة للنسخ المتماثل لفيروس التهاب الفم الحويصلي، أنها تستبعد siRNA يضرب بتخفيض صلاحية خلية من الانحرافات المعيارية > 3.0 من الوسط. تم تحديد متوسط عدد الخلايا استناداً إلى تلطيخ هويشت نواة الخلية، وعلى الرغم من عدم وضوح، يعني على ما يبدو كانت تحسب على أساس كل لوحة كما واضح أنه يعني إشارة بروتينات فلورية خضراء كانت تحسب على أساس كل لوحة.

وجود قيود على أي شاشة [رني] الفائق هو عدد عالية متكررة كاذبة إيجابيات وسلبيات، الذي يمكن أن يأتي نتيجة لتصميم المقايسة، والتكنولوجيا المستخدمة أو عن طريق أخطاء منهجية. على سبيل المثال، بروتين قد تؤثر تأثيراً كبيرا على النسخ المتماثل لهذا الفيروس، ولكن الوقت المختار لإسكات الجينات قد تكون قصيرة جداً نظراً لفترة نصف العمر للبروتين للكشف عن تأثيره مما يؤدي إلى سلبية كاذبة بحكم تصميم المقايسة. ومن الثابت أن ضربة قاضية ناقصة وآثار التكنولوجيا siRNA خارج الهدف ويمكن أيضا إدخال كاذبة إيجابيات وسلبيات. أخطاء منهجية، مثل تأثير الحافة32، يمكن أن تولد نتائج مضللة أيضا. هنا قد تكون الإشارات في الآبار الخارجي اللوحة بشكل منهجي أعلى أو أدنى من بقية اللوحة بسبب التبخر. وهناك استراتيجيات لمعالجة بعض هذه القضايا بما في ذلك، على سبيل المثال: تناقص تركيز siRNA للحد من آثار خارج الهدف33، وإعادة تكوين تخطيطات لوحة لملء الآبار الخارجي مع وسائل الإعلام للتخفيف من تأثير الحافة، أو التي تستخدم تأثير الطرق الحسابية التي تم وضعها لكشف ومواجهة أخطاء منهجية مثل الحافة32،،من3435. طريقة عامة للتعامل مع إيجابيات كاذبة إجراء شاشة ثانوية التالية على الشاشة الرئيسية. كوسيلة للتعامل مع السلبيات الكاذبة، واحد قد الاسترخاء وقف إنتاج المواد الانشطارية لضرب الدعوة، وتشمل السلبيات الكاذبة المحتملة للفحص الثانوي. وهذا، بطبيعة الحال، لا التقاط السلبيات الكاذبة التي أقل بكثير وقف إنتاج المواد الانشطارية. شاشات الأولية ينبغي أن تجري أيضا في تكرار أو ثلاث نسخ للحد من نتائج زائفة. في نهاية المطاف، بغض النظر عن ما هي الاستراتيجيات التي تستخدم، وسيحدد أي الشاشة الفائق استفاضة جميع الزيارات الحقيقية، ولكن يمكن أن توفر كنز من البيانات من خلاله واحدة من المرجح أن الألغام بعض مرات القيمة التي يمكن الاستفادة.

في هذا البروتوكول، وصفت لنا استخدام siRNA صفت والتكنولوجيا شرنا، على الرغم من أن ثمة بديل آخر هو استخدام شرنا المجمعة ومكتبات كريسبر-Cas9. مكتبة شرنا مجمعة كان يعمل في ووركينهي et al. 12 الدراسة المبينة في المقدمة. وقد استخدمت المجمعة كريسبر-Cas9 تكنولوجيا إجراء شاشات الجينوم-مقياس لتحديد العوامل المضيفة المطلوبة للنسخ متماثل فيروسات مثل Zika فيروس36، والفيروسات37،38غرب النيل، وحمى الضنك فيروس39 والتهاب الكبد ج الفيروسات39. وميزة استخدام المكتبات المجمعة أنها أقل تكلفة لشراء، لا تتطلب البنية التحتية المتخصصة (مثل التعامل مع الأجهزة ومجاهر عالية المحتوى، والمعدات الروبوطيه السائل)، وليس لهم ارتفاع تكاليف التشغيل والحفاظ على هذه البنية الأساسية، وأنها تتطلب عددا أقل من المواد الاستهلاكية. العيب أن أنواع قراءات محدودة بدرجة أكبر. في مكتبة تجميع معظم أن لم يكن جميع الشاشات التفاعل المضيف للفيروسات حتى الآن، هو قراءات بقاء الخلية أو عدم وجودها؛ واحد لا يمكن التحقيق في سهولة لتعمل أكثر تعقيداً. اختيار تنسيق يعتمد على السؤال البيولوجية.

التقدم في تكنولوجيا الفحص الوراثي على مدى العقود العديدة الماضية أن أول شاشات ممكنة في البكتيريا والخميرة إلى شاشات الجينوم-مقياس الوقت الحاضر الآن في الخلايا البشرية قد فتحت الباب على مصراعيه لاكتشاف في ميادين متنوعة من الدراسة. هذه الشاشات الوراثية فقط لم تسمح لنا بالإجابة على أسئلة البيولوجيا الأساسية، بل قدموا لنا مفاتيح لفتح رؤى في تطوير وتحسين بيوثيرابيوتيكس. بينما لا تزال هناك الدروس المستفادة والتحديات التي يجب التغلب عليها مع هذه التكنولوجيا، والنتائج حتى الآن كانت مثيرة. الاكتشافات سيكون على الأرجح أكبر من الرواية كما فحص التكنولوجيا بما في ذلك المكتبات كريسبر-Cas9، ميكروفلويديكس في فيفو فحص تكنولوجيات تواصل وناضجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل منح مقدمة من معهد أونتاريو لبحوث السرطان، ومؤسسة كندا للابتكار، ومؤسسة مكافحة السرطان الإقليمي في أوتاوا، ومعهد أبحاث تيري فوكس. K.J.A. أيده على "كندا فانييه منحة الدراسات العليا"، المعهد الكندي لجائزة بحوث ماجستير من الصحة، و "منحة الدراسات العليا أونتاريو".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
siRNA library GE Dharmacon G-005005-02
Corning 384-well plate Corning 3985
Falcon 384-well plate Becton Dickinson 353962
Water Sigma W4502
siGenome SMARTpool PLK1 GE Dharmacon M-003290-01
AllStars Negative Control siRNA Qiagen SI03650318
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 GE Dharmacon D-001206-14-20
DMEM/HIGH Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30022.01
Fetal Bovine Serum Sigma F15051-500ML
HEPES solution (1M) Sigma H3535-100ML
Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 2500056
DPBS/Modified GE Healthcare Life Sciences SH30028.02
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778100
Oligofectamine Thermo Fisher Scientific 1225011
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 22600-050
Resazurin sodium salt Sigma R7017-5G
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H21492
Formaldehyde (37% by weight) Fisher Scientific F79-4
500 ml bottles Corning 430282
Adhesive Sealing Film For Microplates Excel Scientific 361006007
Peelable Heat Sealing Foil Thermo Fisher Scientific AB-3720
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette Fisher Scientific 11-120-625
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MicroFlo Select (liquid dispenser) Fisher Scientific 11120621
BioTek Synergy HT plate reader Biotek N/A
Opera Imaging and Analysis Instrument PerkinElmer HH10000115
KiNEDx Robotic Arm Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) KX-300-660
Cytomat 24C Series Automated Incubator Thermo Fisher Scientific 50080227
JANUS Automated Workstation PerkinElmer AJI4M01
Plate Carousel Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) N/A
Alps 3000 plate sealer Thermo Fisher Scientific AB-3000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
  2. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
  3. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
  4. Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
  5. Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
  6. Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
  7. Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
  8. Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
  9. Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
  10. Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).
  11. Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
  12. Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
  13. Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
  14. Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
  15. Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
  16. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
  17. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
  18. Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
  19. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
  20. Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  23. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  24. Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
  25. Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
  26. Luc, P. -V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
  27. Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
  28. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  29. Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
  30. Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
  31. Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
  32. Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
  33. Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
  34. Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
  35. Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
  36. Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
  37. Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
  38. Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
  39. Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 134، أونكوليتيك، الفيروسات، [رني]، شاشة، الفائق، السرطان، اللقاحية، رهابدوفيروس، الخلية، المضيف، والجينوم الوظيفي
الفرز على نطاق الجينوم [رني] تحديد العوامل المضيفة التي تعدل علاج فيروس أونكوليتيك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, … More

Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, S. D., Lefebvre, C. A., Stojdl, D. F. Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy. J. Vis. Exp. (134), e56913, doi:10.3791/56913 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter