Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Genome-wide RNAi Screening att identifiera värd faktorer som modulerar onkolytisk Virus terapi

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/56913
Automatic Translation
1,2, 1,4, 1, 1, 1,2,3
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för att anställa hög genomströmning RNAi screening att avslöja värd mål som kan manipuleras för att förbättra onkolytisk virus behandling, särskilt rhabodvirus och vaccinia virus terapi, men det kan lätt anpassas till andra onkolytisk virus-plattformar eller för att upptäcka värd gener som modulera virusreplikation generellt.

Abstract

Hög genomströmning genome-wide RNAi (RNA-interferens) screening teknik har använts för att upptäcka värd faktorer som påverkar virusreplikation. Här presenterar vi tillämpningen av denna teknik avtäckning värd mål som modulerar replikering av Maraba virus, onkolytisk rhabdovirus och vacciniavirus med målet att förbättra terapi. Medan protokollet har testats för användning med onkolytisk Maraba och onkolytisk vacciniavirus, denna metod är tillämplig på andra onkolytisk virus och kan också användas för att identifiera värd mål som modulerar virusreplikation i däggdjursceller i Allmänt. Det här protokollet beskriver utveckling och validering av ett test för hög genomströmning RNAi screening i däggdjursceller, viktiga överväganden och förberedelser som är viktiga för att bedriva en primär hög genomströmning RNAi skärm och en stegvis guide för genomföra en primär hög genomströmning RNAi skärm; Dessutom beskrivs det i stort sett metoderna för att genomföra sekundär skärm validering och tertiär valideringsstudier. Fördelen med hög genomströmning RNAi screening är att det tillåter en att katalogisera, i en omfattande och förutsättningslös mode, värd faktorer som modulerar någon aspekt av virusreplikation som man kan utveckla ett in vitro- test såsom smittsamhet, brast storlek, och cytotoxicitet. Det har befogenhet att avslöja bioterapeutiska mål oförutsedda baserat på nuvarande kunskap.

Introduction

Hög genomströmning genome-wide RNAi screening har visat sig vara ett ovärderligt verktyg för att avslöja biologisk insikter inom skilda områden av studien inklusive virus biologi. Under det senaste decenniet eller så, många grupper har åtagit sig cellbaserade storskaliga RNAi screening för att i stor utsträckning identifiera värd gener som modulerar virusreplikation (granskad i1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). intressant, ett stort antal av dessa skärmar har utförts i cancerceller och flera med virus som är nuvarande onkolytisk virus kandidater inklusive vaccinia virus8,9,10 , Myxoma, som producerats virus11, herpes simplex virus12, vesikulär stomatit virus13,14och Maraba virus15. Medan fokus för flesta av dessa studier var att identifiera värd faktorer som påverkar vissa aspekter av virusreplikation och inte identifiera bioterapeutiska mål för att förbättra onkolytisk virus terapi, kan värdefulla data brytas från dessa datamängder i detta avseende. Det är tydligt att kraftfulla potential att identifiera värd mål som kan manipuleras för att förbättra onkolytisk virus behandling inte har utnyttjats fullt ut.

En uppsjö av onkolytisk virus plattformar testas för närvarande i prekliniska och kliniska studier inklusive herpes simplex virus, reovirus och vaccinia virus, som har haft påvisbar framgång i sent stadium kliniska prövningar. För flesta av dessa plattformar, har insatser riktats mot att förändra virus genomen att förbättra behandling. Exempelvis för att öka tumör specificitet, har specifikt virus gener raderats eller muterade för att avsevärt begränsa virusreplikation i normala celler, men inte i tumörceller. I vissa fall transgener har lagts till som GM-CSF (granulocyt makrofag granulocytkolonistimulerande faktor) att förstärka immunsvaret eller NIS (natrium jodid symporter) att aktivera i vivo imaging och cellulär radioiodide upptag för terapeutiska ändamål. Det har dock varit mycket lite arbete inriktat på att manipulera värd/tumör gener och utforskar inverkan värd/tumör gener på onkolytisk virusreplikation. Med tillkomsten av high-throughput screening teknik, är det nu möjligt att probe värd-virus interaktioner i genomet skala och dechiffrera möjligheter att manipulera värd genomet för att förbättra onkolytisk virus behandling (recenserade i16, 17,18).

Vi rapporterade den första studien visar proof-of-concept för att använda hög genomströmning genetisk screening för att identifiera värd mål som kan manipuleras för att förbättra onkolytisk virus behandling. För att upptäcka värd gener som modulerar Maraba virus oncolysis, en onkolytisk rhabdovirus för närvarande testas i fas I och II-studier, genomförde vi genome-wide RNAi skärmar över tre olika tumör cellinjer i två exemplar med en siRNA (kort störande RNA) biblioteket riktar sig 18,120 gener15. Väg analys av hits som identifierats i skärmarna avslöjade anrikning av medlemmar av ER (endoplasmatiska retiklet) stress svar vägar. Vi valt ut 10 träffar inom dessa vägar för sekundära validering med siRNA med olika inriktning sekvenser från de av den primära skärmen. Som en del av tertiär validering, vi har utfört en räddning experiment med IRE1α (inositol-kräver enzymet 1 alpha) för att bekräfta att träffen var på målet. In vitro och i vivo tester med en liten molekyl hämmare av IRE1α resulterade i dramatiskt förbättrad onkolytisk effekt.

Workenhe et al. 12 genomförde också en genome-wide RNAi-skärm som använder en poolad lentiviral shRNA (kort hårnål RNA) bibliotek inriktning 16,056 gener för att identifiera värd faktorer begränsar människors herpes simplex virus typ 1 (HSV-1) mutant KM100-medierad oncolysis av bröst cancerceller. I den primära skärmen identifierade de 343 gener överväldigande som leder till förbättrad cytotoxiciteten hos KM100-infekterade celler över mock-infekterade celler; de utvalda 24 av dessa gener för sekundära validering. Av de 24 generna, 8 gener bekräftades i den sekundära skärmen med en av dem är SRSF2 (serin/arginin-rika skarvning faktor 2) vilket bekräftades därefter med en genetisk räddning experiment under tertiär validering. Gruppen fortsatte med för att identifiera en DNA topoisomeras hämmare kemoterapeutiska som minskar fosforyleringen av SRSF2 och visade att kombinationsbehandling av HSV-1 KM100 med denna hämmare leda till förlängd överlevnad av TUBO tumör-bärande möss.

I ovan nämnda studier följdes ett liknande arbetsflöde. Varje började med en primär genome-wide RNAi skärmen följt av en sekundär skärm på ett utvalt antal träffar som identifierats i den primära skärmen. Detta följdes av tertiär valideringsstudier, vilket inkluderade bekräftar att träffen var på målet genom att utföra genetiska rädda experiment in vitro med ultimate validering utförs genom att manipulera mål genen produkt i vivo. I den här artikeln ger vi först en allmän protokoll för utveckling och validering av en hög genomströmning siRNA-screening test, vilket innebär att fastställa optimala transfection villkoren, mängd virus, och längden på infektion. Vi erbjuder också ett detaljerat protokoll för att bedriva en primär en hög genomströmning siRNA skärm samt en övergripande beskrivning av metoden för att utföra sekundär skärm validering och tertiär validering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utveckling och validering av en hög genomströmning siRNA screening test

Obs: För alla experiment, använda Hepes-buffrat tillväxt medier lämpliga för varje cellinje. Se figur 1 för en översikt av arbetsflödet från assay optimering till tertiär validering.

  1. Bestämning av optimala transfection villkor
    1. Välj en tumör cell fodrar eller helst flera tumör celler linjer att optimera transfection villkor (t.ex. 786-O, SF268, U20S, U373, NCI-H226, OVCAR-8; Se diskussion för mer information om val av cellinjer).
    2. Välj en transfection reagens eller flera att testa. Det kan vara nödvändigt att testa flera transfection reagenser, som vissa kan vara mer giftigt eller effektiva än andra i en viss cell linje. Också, Tänk på att vissa virusinfektion kan påverka eller kan generera hög bakgrund signal vid imaging.
    3. Besluta om positiva [e. g. siRNA inriktning PLK-1(Polo Like Kinase 1) mRNA, som inducerar celldöd] och negativa transfection kontroller (t.ex. icke-targeting siRNA).
    4. Följ omvänd transfection protokollet för den särskilda transfection reagensen, men variera mängden transfection reagens (t.ex. 0,05, 0,1, 0,15 och 0,2 μl per brunn) och cell sådd tätheter (t.ex. 625, 1250, 2500 celler per brunn). Inkluderar replikat av följande villkor: obehandlad celler, håna transfekterade celler (dvs celler plus transfection reagens) och celler transfekterade med positiva och negativa transfection kontroll siRNA (se figur 2A på en prov-skylt layout).
      1. I allmänhet, förbereda 80 nM utspädningar av varje siRNA för en slutlig koncentration i brunnen 10 nM (beroende på biblioteket, en högre koncentration av siRNA kan krävas). Om inte annat anges, späd siRNA med transfection reagens spädningsvätska. Preparera utspädningar av transfection reagens.
      2. Pipettera 5 μL av siRNA per brunn följt av 5 μL utspätt transfection reagens. För att underlätta detta steg, fördela längs en kolumn med en U-botten 96 brunnar tallrik, siRNA mixar och siRNA spädningsvätskan ensam (för obehandlade och håna transfekterade celler). Fördela längs en andra kolumn, utspädda transfection reagens och transfection reagens spädningsvätska ensam (för obehandlade celler).
        1. Med hjälp av en elektronisk Pipettera, Pipettera 5 μL/brunn av innehållet i den första kolumnen som innehåller siRNA eller siRNA spädningsvätska i motsvarande brunnar av plattan med 384 brunnar följt av 5 μL/brunn av utspädda transfection reagens eller transfection reagens spädningsvätska från den andra kolumnen.
      3. Centrifugera plattorna vid 1026 x g för 1 min i rumstemperatur, och Inkubera under den tid som föreskrivs för transfection reagens (t.ex. 5-20 min).
      4. Medan plattorna ruvning, förbereda cellsuspensioner av olika densiteter. Pipettera 30 μl cellsuspension per brunn. Innan du lägger plattorna i inkubatorn, låt plattorna sitta i 45-60 min i rumstemperatur att möjliggöra enhetlig reglerandet av celler19.
        Obs: Om inkubationstiden föreskrivs för transfection reagens med siRNA är kort, förbereda cellsuspensioner innan inkubering.
      5. Inkubera i 48-72 h beroende på önskad längd på knockdown valt för skärmen.
    5. Förbereda en fixande och färgning lösning bestående av formaldehyd, Hoechst 33342 och PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning) för en slutlig koncentration i varje brunn 4% formaldehyd och 5 ug/mL Hoechst 33342. Som behövs, prova en högre (t.ex. 7,5 µg/mL) eller lägre koncentration (t.ex. 2 ug/mL) av Hoechst om signalen är för svag eller för stark, respektive.
    6. Fördela 30 μL av fastställande och färgning lösningen direkt i alla brunnar. Inkubera plattorna under 30 minuter vid 37 ° C. Lagra plattorna vid 4 ° C. Om du använder ett icke-confocal Mikroskop, tvätta plattorna med PBS med hjälp av en tallrik bricka; i de flesta fall är tvätt onödigt när du använder en confocal mikroskopet.
    7. Utveckla ett skript för att kvantifiera antalet celler per brunn.
      Obs: Det finns flera programserier för detta ändamål och, var och en kan ha olika sätt att generera skript, de alla generellt har ett medel för att identifiera atomkärnor, celler och områden av intresse samt beräkning av stödnivåer och morfologiska egenskaper. När man utvecklar ett screening-skript, är det viktigt att beakta den tid som krävs för att köra skriptet per platta och kanske inkludera endast viktiga mätningar för att minimera handläggningstiden. Exempelvis för att kvantifiera antalet celler, kan man beräkna området Hoechst per väl över en viss intensitet; och för att kvantifiera virus spridning, kan man beräkna området GFP (grönt fluorescerande protein) per väl över en viss intensitet. ”Uppgången ner” skriptet behöver jämföras med mer avancerade skript för att säkerställa att ingen viktig information går förlorad.
    8. Analysera resultaten för att fastställa optimala transfection villkoren, som är mängden transfection reagens och cellen sådd densitet som resulterar i betydande celldöd (0-30% cellöverlevnad) och är minimalt giftiga till cellerna (t.ex. 90-100% cellöverlevnad). Obs: Det kan ta längre tid att iaktta den cell death fenotypen i cellinjer med långa fördubbling gånger. Se figur 2B och 2 C för representativa resultat. Kontrollera också att cellerna transfekterade med icke-targeting siRNA är cirka 90-100% konfluenta vid tidpunkten för fixering som senare kommer en vill infektera celler som är av denna konfluens.
  2. Fastställande av den optimala mängden virus och längd av infektion
    1. Utföra omvänd transfection stegen som beskrivs ovan (se 1.1.4.1 till 1.1.4.4); men använder bara optimal transfection villkor (se punkt 1.1.8) (t.ex. för 786-O celler: 1500 celler per brunn och 0,05 μL/brunn av RNAiMAX) och dessutom inkluderar extra brunnar vara infekterade med virus [t.ex. brunnar med obehandlade celler, mock transfekterade celler, celler transfekterade med icke-targeting siRNA och celler transfekterade med positiva virus kontroller om de är kända (dvs siRNA inriktning värd gener som kommer att hämma eller förbättra replikering)].
      1. Se figur 3A för en layout med prov i plattan. Inkubera i 48-72 h.
    2. Infektera ytterligare virus brunnarna med en onkolytisk virus uttrycker ett fluorescerande reporter-protein (t.ex. god Jordbrukarsed) med ett utbud av multiplicities av infektion (MOIs) (e.g. 0.001 till 10; Intervallet valt vara beror på nivån på motstånd eller mottaglighet hos cellinje.). Inkludera icke-infekterade brunnar samt. Pipettera 40 μl av varje virus utspädning per brunn för en slutlig volym av 80 μl. Centrifugera varje platta 400 x g i 30 min i rumstemperatur.
    3. Följande infektion, bild cellerna lever med en hög-innehåll, automatiserad Mikroskop med jämna mellanrum (t.ex. varje 4-8 h). Se figur 3B och 3 C.
    4. Utveckla ett skript för att kvantifiera virus spridning (t.ex. god Jordbrukarsed område per brunn) (se 1.1.7). Analysera bilderna och välj en tidpunkt och en MOI som möjliggör upptäckt av ökningar och minskningar i spridningen. Säkerställa en tidpunkt och MOI falla inom ett linjärt intervall att underlätta upptäckt av små förändringar i spridningen. Uppskatta den Z-faktorn (eller Z') för given tidpunkt och MOI.
      Obs: Beräknad Z-faktorn = 1-3 (σp + σn) / | μp- μn|, där σp är provets standardavvikelse av positiva virus kontroller och σn är provets standardavvikelse av negativa virus kontroller. och μp är sampelmedelvärdet av positiva virus kontroller och μn sampelmedelvärdet av de negativa kontrollerna. En uppskattad Z-faktor 0,5 - 1,0 är anses vara en utmärkt analys och lämplig för screening20,21.
    5. Bekräfta att den negativa virus kontroll siRNA har ingen inverkan på virusreplikation genom att jämföra det håna transfekterade och obehandlat brunnarna. Det är ofta nödvändigt att testa flera negativa kontroller som vissa negativa siRNA kontroller kan påverka virusreplikation.
  3. Slutlig kontroll av high-throughput screening analysens
    1. Upprepa steg 1.2.1 och 1.2.2 ovan, men endast denna tid infektera celler med den optimala MOI. I stället för levande imaging, fixa och fläcken plattan (som beskrivs i 1.1.5 och 1.1.6) vid optimal tidpunkt (se 1.2.4).
    2. Bild på plattan. Analysera resultaten med samma manus som ska användas för skärmen (se 1.1.7 och 1.2.4). Bekräfta de transfection villkor (dvs bra knockdown i brunnar transfekterade med positiva transfection kontroll och minimal toxicitet i brunnar transfekterade med negativa transfection kontroll). Uppskatta den Z-faktorn för att fastställa robustheten i analysen (se 1.2.4).
  4. Ytterligare tester och överväganden för att bedriva high-throughput screening
    1. Testa hållbarheten av mikrotiter plattorna som vissa plattor kan spricka under centrifugeringen, särskilt när locken hålls och flera plattor centrifugeras på en gång. Att minska sprickbildning, Centrifugera utan lock (förutsatt att plattorna har tätningar), eller minska antalet plattor centrifugeras per hink.
    2. Testa transfection reagens mixen stabilitet över tid. När transfection reagensmedlet läggs till plattorna, kan det finnas en betydande fördröjning innan tillägg av celler; Därför är det viktigt att veta tidsperioden för vilken transfection reagens mixen förblir effektiva. För skärmen, kan det vara nödvändigt att förbereda celler i förväg lägga transfection reagens mixen till plattorna.
    3. Förbereda för att använda den flytande dispensern. Fastställa vilka volymer som krävs för att dispensera transfection reagens, celler, virus och fixa med hänsyn till volymen att slangen lastrummen, volymen förlorade till före dispensering (om enheten har denna funktion), och den återstående volymen som krävs i de flaskor som används för dispensering.
      1. Ställa in och testa program som kommer att användas för dispensering transfection reagens, celler och virus. För att minimera förlusten av transfection reagens, gräns, om möjligt, antalet pre doserar. Upprätta ett protokoll för att kalibrera den flytande dispensern och testa dess noggrannhet och precision.
    4. Förbereda för bulk munstycket transfection reagens, celler och virus
      1. Först bestämma antalet plattor som ska bearbetas i batch med tanke på antalet plattor av celler som rimligen kan vara trypsinized på en gång, antalet mikrotiter plattor som kan centrifugeras på en gång, hur lång tid som krävs för att bearbeta en batch av plattor med den flytande dispensern, och även den tid som krävs för avbildning. Obs: Generellt bearbetning ca 30 plattor på en gång är helt genomförbart och bearbetning 3 partier av plattor är hanterbara på en dag.
      2. Empiriskt verifiera volymen av transfection reagens som krävs för att bearbeta en batch av plattor. Test som denna volym är adekvat av tubens 5 μl destillerat vatten flera gånger över en tallrik motsvarande antal gånger som kommer att krävas för att bearbeta en batch.
      3. För att säkerställa en jämn fördelning av celler, uppskatta tid som krävs att avstå från celler över en batch av plattor. Förbered en flaska som innehåller volymen av celler som krävs för en batch och fördela cellerna i flera kolumner i en platta i taget, med jämna mellanrum under samma tid det tar för att fördela över ett parti av plattor. Testa hur ofta det kommer att bli nödvändigt att blanda cellerna för att upprätthålla en jämn fördelning av celler.
      4. För att säkerställa en jämn fördelning av virus, upprepa samma procedur som ovan (se 1.4.4.3), men den här gången dispensering virus på konfluenta brunnar. Om viruset inte är jämnt fördelad, överväga att utarbeta viruset i koniska rör och vortexa varje rör före dispensering.
    5. Spåra tillväxten av celler att bestämma tidslinjen för att odla tillräckligt med celler för skärmen. Ta också reda på det genomsnittliga antalet celler som kan skördas per platta celler som växer i loggen fas för att kunna uppskatta det antal som krävs för skärmen.
  5. Slutliga förberedelser för high-throughput screening
    1. Upp till en månad innan screening, bestämma allt material som behövs för skärmen. Beställa reagensmedel krävs (se material). Säkerställa den nödvändiga mängden virus är å (helst använda samma bestånd som användes under optimeringen.).
    2. Upp till två veckor innan screening, Tina och växa upp cellerna krävs för skärmen. Tillförsäkra att Centrifugera och fyrkantig centrifug hinkar.
    3. Under veckan innan screening, förbereda media flaskor för omvänd transfection och infektion, ett lager av 70% etanol, 2 X transfection reagens spädningsvätska (t.ex. 2 X Opti-MEM), om nödvändigt (t.ex. om siRNA biblioteket späds i RNase-free vatten, en kommer att vilja använda 2 X till transfect celler), och alikvoter av virus (en per batch av plattor). Kontrollera skicket på cellerna.
      1. Förbereda en stamlösning av Hoechst 33342 fläcken (t.ex. 5 mg/mL). Förbereda en balans plattan om man kommer att krävas för centrifugering.
      2. Se till att plattan brickan är i bra skick om det ska användas. Kontrollera den flytande dispensern är rätt kalibrerad och munstycket noggrant och exakt. Kontrollera också programmen är korrekt inställda på den flytande dispensern.

2. genomför skärmen primära hög genomströmning

Obs: Innan skärmen RNAi, mikrotiter plattor (t.ex. 384 brunnar) måste vara klädd med siRNA bibliotek och screening kontroller. Följande steg utförs bäst av två personer med en person (dvs. Person A) som primärt ansvarar för att de transfection reagens och celler över plattorna och den andra personen (dvs. Person B) som ansvarar för centrifugering plattorna omedelbart före transfection och för att förbereda cellerna. I parenteser ingår några specifika för bearbetning en batch av 33 plattor (dvs. hälften av biblioteket) med 786-O cell-linjen.

  1. Förberedelse för omvänd transfection
    1. Person A: placera tillräckligt media, trypsin och PBS nödvändigt att bearbeta en batch av plattor i 37 ° C vattenbad. Tillval: Trypsinize en platta av celler, och räkna antalet celler per platta för att ge en realtid uppskattning av antalet plattor som krävs per batch.
    2. Skaffa ett parti av plattor (t.ex. 33 pläterar) från frysen och vänta 20-30 min så att plattorna att Tina. Medan plattorna avfrostning, Fortsätt med följande steg.
      1. Person A: pipettera till 50 mL koniska rör mängden transfection reagens spädningsvätska behövs för att bearbeta en batch av plattor (t.ex. 2 x 37.125 mL) och placera dem i 37 ° C vattenbad. Fyll två flaskor med 70% etanol (t.ex. 250-500 mL flaskor). Fyll två 50 mL koniska rör med PBS och en med destillerat vatten.
      2. Person A: fördjupa den flytande dispenser slangar till en flaska 70% etanol. Om alla tips inte kommer att användas för dispensering transfection reagens (t.ex. om de yttre brunnarna i plattan inte används), lossa den onödiga slangar först. Lägg en bit maskeringstejp runt slangen att markera den punkt under vilken slangen kan anses vara sterila. Prime med ca 25 mL. Häll ytterligare etanol i flaskan för att ersätta den förlorade volymen. Låt slangen sitta i etanol i minst 5 min.
      3. Person B: Förbered att trypsinize celler. Spray vävnadsodling (TC) huven med 70% etanol. Spraya och placera de nödvändiga pipetter, tips, flaskor och microfuge rör för att förbereda celler i huven (se 2.2.1.1 och 2.2.1.2). Centrifugera förseglade plattorna i uppsättningar på 1026 x g under 2 minuter vid rumstemperatur. Ta bort locken från plattorna i en TC huva, om tidigare fastställts att plattorna kan spricka under centrifugeringen när locken hålls på (se 1.4.1).
    3. Person A: ta bort tätningarna från plattorna. Före, under eller efter sälarna har tagits bort (beroende på längden på inkubation krävs), Pipettera mängden transfection reagens (t.ex. 375 μL/tub för en slutlig koncentration av 0.05 μl av RNAiMAX per brunn) in i koniska rören som innehåller pre värmde transfection reagens spädningsvätskan (t.ex. 37.125 mL/tub).
    4. Blanda genom pipettering upp och ner 10 gånger. Odla i rumstemperatur under den tid som föreskrivs för transfection reagens används (t.ex. 0-10 min).
  2. Omvänd transfection
    1. Har Person B utföra följande uppgifter.
      1. Börja trypsinizing cellerna (t.ex. 3 plattor av 786-O celler). Aspirera media från varje platta. Skölj med 9 mL PBS. Pipettera 3 mL av trypsin per platta. Inkubera vid 37 ° C för cirka 5 min. Omsuspendera cellerna med 22 mL av media. Pipettera upp och ner 10 gånger.
      2. Kombinera cellsuspensionen från varje vävnadsodling platta i en steril flaska. Blanda cellsuspensionen genom att vända. Pipettera 1 mL alikvoter av cellsuspensionen i två separata microfuge rör. Ta bort ett prov från varje mikrofugrör och räkna cellerna. Beräkna volymen av cellsuspensionen krävs för densitet krävs (t.ex. 1500 celler per brunn), och förbereda tillräckligt utspädda cellsuspension (t.ex. 500 mL) att fördela över en batch av plattor.
    2. Har Person A utföra följande uppgifter parallellt till Person B.
      1. Töm den flytande dispensern slangar av etanol. Prime slangen med ca 25 mL i PBS, och töm sedan slangen. Var försiktig vid hantering av slangen för att säkerställa att delen av slangen nedanför maskeringstejp som kommer att vara nedsänkt i transfection reagens och senare i cellsuspensionen hålls sterila. Ställa isär plattor som säkert kan göras med en konisk tub transfection reagenslösningen.
      2. Pipettera transfection reagens lösningarna upp och ner 10 gånger. Prime slangen med transfection reagenslösningen. För att minimera förlusten av transfection reagens, prime med lagom lösning att knappt klara tips. Välj den rätta programmet på den flytande dispensern och fördela 5 μl transfection reagens per brunn.
        FÖRSIKTIGHET: Noga övervaka nivån av transfection reagens så att det fylls innan det rinner ut. Slutförandet av plattorna som är uppsättning apart bör ge en cue för att lägga till fler transfection reagenslösningen.
      3. Centrifugera plattorna vid 1026 x g för 1 min i rumstemperatur. Denna gång locken kommer att vara på, så det kan vara nödvändigt att Centrifugera mindre plattor samtidigt för att förhindra sprickbildning (t.ex. 2 plåtar per hink). Inkubera plattorna vid rumstemperatur under den tid som föreskrivs för transfection reagens används (t.ex. 10-20 min).
      4. Under inkubationstiden, tömma slangen av transfection reagenslösningen och placera det i en fullständig 50 mL koniska tub som innehåller PBS. Skölj slangen med cirka 25 mL PBS av priming och tömning.
        1. Om flera av tipsen kommer att användas för dispensering celler än användes för dispensering transfection reagens, åter fästa oanvända slangen och åter sterilisera alla slangen med 70% etanol före sköljning slangen med PBS (se 2.1.2.2).
      5. Blanda flaskan som innehåller cellsuspensionen när det har utarbetats. Placera slangen i cellsuspensionen och prime nog att se att varje spets dispensering ordentligt. Dosera 30 μl per brunn av cellsuspensionen över alla plattorna. Om nödvändigt, blanda cellsuspension med jämna mellanrum att undvika lösa.
        FÖRSIKTIGHET: Ibland droppar suspension som innehåller media kan fastna på sidorna av tips. När detta observeras, aspirera så snart som möjligt eller torka med luddfri vävnad doused i 70% etanol.
      6. Töm slangen av cellsuspensionen. Skölj slangen med cirka 25 mL PBS, följt av ca 50 mL destillerat vatten.
    3. Låt plattorna att sitta i 45-60 min från tiden i cellen sådd i rumstemperatur innan du återvänder plattorna till inkubatorn. Inkubera plattorna i en ostörd inkubator för önskad längd av gen tysta (t.ex. 48 h) (se 1.1.4.5).
  3. Infektion
    1. För att spara tid, dagen före infektera cellerna, Pipettera till sterila flaskor den exakta mängden media krävs att infektera varje omgång plattor inklusive media för oinfekterade brunnar (t.ex. 2 x 350 mL och 2 x 50 mL för 33 plåtar). Dessutom testa de flytande dispensern för precision och noggrannhet, och kalibrera om det behövs.
    2. Värma media vid 37 ° C. Fyll två flaskor med 70% etanol, två 50 mL koniska rör med PBS och en med destillerat vatten. Kontrollera att centrifugen är vid rumstemperatur.
    3. Sterilisera slangen med 70% etanol, och skölj med PBS som tidigare beskrivits (se 2.1.2.2 och 2.2.2.1). Medan slangen sitter i etanol, Pipettera exakt mängden virus som krävs i flaskan som innehåller media tidigare förberedd för infektion (se 2.3.1). Skölj slangen med PBS av grundning med 25 mL och sedan tömma.
    4. Ta bort plattorna från inkubatorn och placera dem i TC huven. Prime slangen med media. Fördela 40 μl av media i de oinfekterade kontrollbrunnarna. Töm slangen av media och skölj med 25 mL PBS. (se 2.2.2.5 för försiktighet)
    5. Efter blandning viruset, Placera slangen i flaskan som innehåller viruset. Fördela 40 µl av virus över plattorna. Centrifugera plattorna för 30 min vid 400 x g vid rumstemperatur. Tillbaka plåtarna till inkubatorn. Inkubera plattorna för den tidigare fastställd tidsperiod (t.ex. 24 h) (se 1.2.4).
  4. Fastställande och färgning celler
    1. För att spara tid, dagen före fastställande, förbereda en flaska fastställande och färgning lösning innehållande formaldehyd och PBS (t.ex. 179 mL 37% formaldehyd och 270 mL PBS för en slutlig koncentration på 4% formaldehyd) för varje parti av plattor, men utelämna den Hoechst fläcken. Förvaras i brandfarligt skåp från ljus.
    2. Skölj slangen med 70% etanol och PBS som tidigare beskrivits (se 2.1.2.2 och 2.2.2.1). Lägga till volymen som krävs av Hoechst (t.ex. 2,5 mL av en 5 mg/mL av Hoechst för en slutlig koncentration i brunnen på 7,5 μg/mL) till fastställande och färgning lösning och blandning.
    3. Dosera 30 μL av fastställande och färgning lösning över alla plattorna. Placera plåtarna i inkubatorn för 30 min. Efter inkubation, gälla plattorna sälarna och lagra plattorna vid 4° C skyddas från ljus. Tvätta plattorna vid behov (se 1.1.6).
  5. Bildbehandling och bildanalys
    1. Bild plattorna med en automatiserad, hög-innehåll Mikroskop. Använd tidigare fastställd inställningar, men först testa inställningarna för att säkerställa att inga justeringar behöver göras.
    2. Kvantifiera GFP (eller andra fluorescerande reporter) och Hoechst område per väl med de tidigare utvecklade skriften (se 1.3.2). Testa skriptet med en handfull pläterar först för att avgöra om några smärre ändringar behöver göras innan batch analysera alla plattorna.
    3. Identifiera träffar. Obs: Robust Z-Poäng/MAD (median absoluta avvikelse) metoden är en metod som ofta används för detta ändamål. Typiskt, betyg för > 2 eller < -2 ställs som cut-off. Denna metod används bäst när siRNA proverna är slumpmässigt fördelad över plattorna och inte, till exempel grupperade efter funktion eftersom proverna används som faktisk negativa kontroller. Filtrera ut cytotoxiska siRNAS som dessa kan förväntas att minska icke-specifikt virus sprids (se diskussion för mer information om filtrering ut cytotoxiska träffar).

3. sekundära skärmen validering av träffar med TRC (The RNAi Consortium) shRNA biblioteket

Obs: Se diskussion för information om att välja träffar för sekundära validering och eventuell screening teknik. Om siRNA teknik väljs för sekundära validering, samma assay utveckling och validering protokoll kan användas som användes för den primära skärmen (se 1).

  1. Få en anpassad TRC shRNA bibliotek inriktning kandidatgener av intresse som glycerol lager.
  2. Förbereda transfection kvalitet plasmid DNA från glycerol bestånden. Obs: Ett detaljerat protokoll (dvs ”shRNA/sgRNA/ORF Glycerol och Plasmid DNA förberedelse”) kan hittas här: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  3. Producera lentiviruses uttrycker shRNA inriktning generna av intresse med de DNA-plasmidsna. Obs: Ett detaljerat protokoll för lentivirus produktion i 96 brunnar [dvs ”shRNA/sgRNA/ORF hög genomströmning Viral produktion (96 väl)”] kan hittas här: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  4. Infektera celler med lentiviruses. Obs: Ett detaljerat protokoll för lentiviral infektion i 96 brunnar (dvs ”Lentiviral infektion”) är tillgänglig online på http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
  5. Infektera celler med onkolytisk virus antingen följande puromycin-markering (se 3.4 för val av protokollet) framgångsrikt sensorik celler eller omedelbart följande transduction (utan puromycin val). För att avgöra den optimala mängden virus och längden på inkubation med virus, använda samma metod som används för den primära skärmen.

4. Tertiary validering

Obs: Syftet med tertiär validering är att främst bekräfta att träffen är på målet, tumör specifika, och förbättrar effekten invivo. Man kan också testa om det modulerar spridning över ett spektrum av tumör cellinjer

  1. Bekräftelse att Nedslagning av kandidat genen är på målet
    1. Först bekräfta att det finns ett samband mellan fenotyp och nedtystning. Använda samma analysen som utvecklades för skärmen eller ändra den för en 6-väl format bedöma den förbättring eller hämning av spridning i större format. Genomföra en tid-kurs med celler transfekterade med siRNA inriktning gene(s) sevärdheter plus och minus virus.
    2. Bild brunnarna som innehåller virus-infekterade celler, och samla de cell-lysates från oinfekterade brunnarna vid regelbundna tidsintervall. Avgöra om det finns en korrelation mellan nedtystning och förbättring eller hämning av spridningen. Bedöma nedtystning av kvantitativa Polymerase Chain Reaction (qPCR) eller Western blotting.
    3. Utföra en genetisk räddning experiment för att bekräfta hit är på målet. Obs: I ett experiment med typiska rescue kandidat genen är bankat-ned med RNAi medan samtidigt celler är transfekterade normalnivå med RNAi resistenta cDNA (e.g. ortholog av genen) uttrycker kandidat genen att avgöra huruvida de fenotyp av genen är återställd eller ”räddade”. Stabil cellinjer överuttryck RNAi resistenta cDNA av kandidat genen av intresse kan också vara anställd.
    4. Alternativt i stället för en genetisk räddning experiment, använda flera ortogonala analyser bekräfta att träffen är på målet [t.ex. avgöra huruvida den samma fenotypen erhålls vid Nedslagning av målgenen med flera siRNAs, på Nedslagning av målgenen i flera stabila cellinjer uttrycker shRNA mot målgenen och på knockout med CRISPR (Clustered regelbundet mellanliggande kort palindromic upprepa)-Cas9-teknik i flera cellinjer.].
  2. Bekräftelse att träffen är tumör-specifika och modulerar spridda över en rad tumör cellinjer
    1. Genomföra en liknande analys som i 4.1.1, men med normala celler samt med andra tumör cellinjer.
  3. Bekräftelse att manipulation av genen kandidat ökar effekten i vivo
    Obs: Nedan beskrivs tre möjliga metoder för att manipulera genen rikta in-vivo.
    1. Hitta en drog att manipulera gen målet. Om det finns en drog som en liten molekyl-hämmare som mål samma gen, administrera det med onkolytisk virus i vivo. Det är viktigt att bestämma den optimala tidpunkten för att administrera läkemedlet.
    2. Ingenjören viruset att hämma eller överuttrycka gen målet beroende på huruvida en önskningar att hämma eller förbättra gen målet. För att hämma genen, ingenjör onkolytisk viruset för att uttrycka en dominerande negativa av genen eller express shRNA inriktning genen. För att öka uttrycket av genen målet, klona onkolytisk viruset med en transgenens överuttryck av genen.
    3. Ingenjören cellinjer med gen bankat-ned eller knackade ut med shRNA eller CRISPR-Cas9-teknik, respektive. Implantat av bakåtkompilerade cellinje och vildtyps-cell line in-vivo och därefter infektera med onkolytisk virus. Obs: Denna metod fungerar som ett proof-of-principle och kan avgöra huruvida investera ytterligare tid och resurser att utveckla en drog för att manipulera den genen i vivo, till exempel, skulle vara värdefullt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En översikt av arbetsflödet för att identifiera värd mål för att förbättra onkolytisk virus behandling presenteras i figur 1.

Som illustreras i figur 1, är den kritiska första steget att bedriva en hög genomströmning RNAi skärm test utveckling. Figur 2A ger en prov plattan layout för transfection optimering analysen. Figur 2B består av representativa bilder av förväntade resultat, och figur 2 c är en representativ tomt på de förväntade resultaten. Efter siRNA knockdown PLK-1, en gen som inducerar celldöd och kan användas som en positiv kontroll för att övervaka siRNA knockdown effektivitet, man förväntar sig cellöverlevnad mellan 0-30%, såvida inte cellinje har en lång fördubbling tid i vilket fall det kommer att ta l ängre att iaktta den cell death fenotypen. Den icke-targeting siRNA bör också vara minimalt giftiga till celler med en liknande relativ överlevnad som obehandlad celler.

En annan viktig del av assay utveckling är att bestämma den MOI att infektera cellerna och tiden för infektion. Figur 3A ger en prov plattan layout för att bestämma mängden virus och längden på inkubation med virus. Figur 3B visar resultaten av en levande tid-jaga av 786-O celler som smittats med vvDD-andra (onkolytisk vacciniavirus uttrycker förbättrade GFP med tymidinkinas och Vaccinia tillväxtfaktor generna borttagna) på olika MOIs. Representativa bilder av celler som smittats med vvDD-andra på en MOI på 0,05 visas i figur 3 c. Baserat på resultaten ritade i figur 3B, kanske en markerar en MOI på 0,05 och en längd av infektion av 21 h som detta skulle möjliggöra för detektion av ökningar och minskningar i spridning eftersom denna tidpunkt är inom ett linjärt intervall, och den beräknade Z-faktorn på detta ti mig-punkten är 0,6 för kohorter som ökar och för kohorter som minska spridningen. Som en del av validering av denna analys, kommer en vilja att åtgärda cellerna på denna MOI och tidpunkt, och beräkna den Z-faktorn.

Efter protokollet beskrivs, genomförde vi genome-wide RNAi skärmar över tre olika tumör cellinjer (e.g. OVCAR-8, U373, NCI-H226) i två exemplar med en siRNA bibliotek inriktning 18,120 gener15. Använder metoden galna identifierat vi 1008 träffar gemensamma för minst 2 av de 3 cancer cellinjer (figur 4A). Väg analys av hits som identifierats i skärmarna avslöjade anrikning av medlemmar av UPR (ovikta protein response) och ERAD (endoplasmatiska retiklet-associerade protein) nedbrytningsvägar (figur 4A). Vi valt ut 10 träffar inom dessa vägar för sekundära validering med siRNA med olika inriktning sekvenser från de av den primära skärmen (figur 4B). Som en del av tertiär validering, vi har utfört en genetisk räddning experiment med IRE1α och ATF6α (aktiverande transkription faktorn 6 alpha) att bekräfta att dessa träffar var på målet (figur 4 c).

Figure 1
Figur 1: Schematisk av arbetsflödet för att identifiera värd mål för att förbättra onkolytisk virus behandling. Det första steget är att utveckla och validera en analysmetod för hög genomströmning RNAi screening, vilket inkluderar optimera transfection villkoren för att införa siRNA i celler, att bestämma den optimala mängden virus (dvs MOI) att infektera cellerna med och längden på inkubation med virus. Det andra steget är att bedriva en hög genomströmning genome-wide skärm. Ett siRNA bibliotek inriktning gener över hela genomet är klädd på mikrotiter plattor. Celler är då omvänd transfekterade med siRNA biblioteket. Efter ett 48-72 h inkubationstiden för nedtystning, är celler infekterade med den optimala mängden virus. Efter den optimala längden för inkubation med virus, är celler fast och målat, och därefter avbildas med ett mikroskop som hög-innehåll. Efterföljande bild och data analys hjälper till att identifiera gener som betydligt modulerar virusreplikation, som benämns ”hits”. En sekundär validering skärm utförs på Välj träffar från den primära skärmen generellt med siRNA eller shRNA med olika fröblandningar regioner. Tertiär validering experiment utförs för att bekräfta att träffarna på målet, tumör specifika och öka effekten i vivo. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: optimering av transfection villkor för hög genomströmning RNAi screening test. (A) en prov plattan layout för att optimera transfection förhållanden med två olika cellinjer. (B) representativa bilder av 786-O celler (1500 celler per brunn) färgas med Hoechst 33342 efter 72 h inkubation med transfection reagens spädningsvätska ensam (dvs obehandlad), transfection reagens och spädningsvätska (dvs mock transfekterade), med icke-targeting siRNA och siRNA inriktning PLK-1. (C) representant resultat från transfection optimering experimentet visar 22% överlevnad av celler transfekterade med PLK-1 siRNA (n = 24) och 94% överlevnad av celler transfekterade med icke-targeting siRNA (n = 8). Felstaplar = ± SD, standardavvikelse; skala barer = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: bestämning av mängden virus och längden på inkubation med virus för hög genomströmning RNAi screening test. (A) en prov plattan layout för att optimera mängden virus och längden på inkubation med virus. Kolumn 1 och 24 innehålla transfection kontroller och är vänster infekterade. Kolumnerna 2 till 23 innehåller obehandlade, håna transfekterade celler och celler transfekterade med positiva och negativa virus kontroller alla infekterade med ett utbud av MOIs börjar med inga virus i kolumnerna 2 och 3. (B) 786-O celler var omvänd transfekterade med icke-targeting siRNA och inkuberas i 48 h. De var därefter infekterade med vvDD-GFP på de MOIs anges och avbildas med 8 h mellanrum börjar på 5 timmar efter infektion (hpi). Genomsnittlig GFP area per brunn (± SD) beräknas för varje tidpunkt (n = 12) och ritas i diagrammet. Z-faktorn beräknas mellan punkterna A och B är 0,6 och Z-faktorn beräknas mellan punkterna B och C är 0,6. (C) representativa levande bilder av en brunn som är infekterade med en MOI på 0,05 vid tidpunkterna som anges. Förstoring, 10 x; 9 fält/väl; skala barer = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Genome-wide skärm identifierar ER Stress svar blockaden som en Potent Sensitizer av Rhabdovirus-medierad Oncolysis. (A) Venndiagram som beskriver antalet överlappande träffar av hög genomströmning RNAi skärmar i 3 tumör cellinjer och en tabell (+, syntetiska dödliga;-, ingen interaktion) och Schematiskt diagram (träffar beskrivs i rött) som illustrerar viktiga träffar inom UPR och ERAD vägar. (B) EG50 Skift (svarta staplar, vänster y-axel) bestämdes för U373 celler behandlas med Maraba virus (48 h) efter behandling med siRNA (72 h) inriktning en rad UPR/ERAD träffar från skärmen. Relativa mRNA uttryck för varje gen efter siRNA knockdown (72 h) avbildas i vitt (höger y-axel). (C) Cell livskraft analyser genomfördes 48 h efter Maraba virusinfektion, i U373 celler som ectopically uttrycker mus ATF6α (eller kontroll GFP) ± siRNA inriktning mänskliga ATF6α (eller icke-inriktning [NT] kontroll; vänstra panelen) eller humant XBP1(s) (eller kontroll ) ± siRNA inriktning mänskliga IRE1α (eller styra; höger panel). Western blotting visar nedtystning och ektopisk genuttryck visas. EG50 skiftar = förskjutningen i dosen av virus som krävs för att döda 50% av cellerna; Felstaplar = ±SD; XBP1(s) = X-box bindande protein 1 (skarvas); (B), enkelriktad ANOVAs utfördes följt av en Bonferroni flera jämförelse post hoc-test för att härleda p värden; (C) utfördes student's t-test för att härleda p värden; * p < 0,05; #p < 0,05. (Denna siffra har ändrats från Mahoney et al., 201115). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi ett protokoll för att anställa hög genomströmning RNAi screening identifiera värd mål som kan manipuleras för att förbättra onkolytisk virus behandling. Detta har testats framgångsrikt med onkolytisk Maraba och onkolytisk vacciniavirus, men, som nämnts, det kan anpassas för användning med andra onkolytisk virus eller andra virus allmänt för att identifiera värd gener som modulerar virusreplikation. Screening protokoll är också utformad för att identifiera gener som kan öka eller minska spridningen, men det kan ändras lätt för andra utläsningar. Våra skärmar med Maraba virus, till exempel utformades för att identifiera gener modulerande oncolysis utnyttja en enkel resazurin-baserade vitala färgämnet analysen för att betyg cellernas viabilitet (se figur 4)15. På dessa skärmar, efter inkubation med virus, istället för att fastställa celler med formaldehyd och färgning med Hoechst, vi dispenseras resazurin färgämne i varje brunn (slutlig koncentration på 20 μg/mL) och, efter ett 6 h inkubation, Vi mätte absorbans (573 nm) med en spektrofotometer. Vi kunde också ha använt cell nummer baserat på Hoechst färgning som en avläsning. Använder en surrogat reporter för att övervaka virusreplikation var onödig i denna skärm, leva ett virus med en reporter protein, särskilt en fluorescerande protein gör det lättare skärmen optimering som en kan, till exempel övervaka virusreplikation; Dessutom ett virus med en reporter protein är mindre omständligt och kostsamt än att använda antikroppar för att färga för virala antigener, men det är möjligt att skärmen utan en. Dessutom kunde man göra ytterligare ändringar av analysen att undersöka värd faktorer som påverkar smittsamhet, burst-storlek och ännu mer detaljerad sub fenotyper som immunologiska celldöd. I varje fall skulle man följa ett liknande test utveckling protokoll, screening strategi och sekundära och tertiära valideringsmetoder.

I protokollet, föreslår vi att optimera transfection villkor helst med flera tumör cellinjer. Det finns åtminstone två skäl för att optimera med flera cellinjer. En anledning är att inte varje cellinje är mottagliga för high-throughput screening som vissa kan vara svåra att transfect eller kan inte hålla sig väl, men en viktig anledning är att möjliggöra screening med flera cellinjer för att undvika cell inneboende bias. Valet av cellinjer är till stor del beroende av ens mål. Man kan välja att fokusera på en viss cancer typ eller Välj olika cancertyper att täcka ett bredare spektrum. Alternativt kan man vill fokusera på tumör cellinjer som är resistenta mot identifiera värd faktorer som kan manipuleras för att göra tumör cell linjer mindre motståndskraftiga mot onkolytisk virusinfektion.

Förutom valet av celler linjer är valet av positiva och negativa virus kontroller en viktig faktor för vilken skärm som helst. I vissa fall kan virus gener som krävs för eller begränsar replikeringen kanske inte är känt eller, om de är kända, kan de vara-specifika. Följaktligen kan man fortfarande bestämma den ungefärliga robusthet och dynamiska omfånget av analysen med hjälp av surrogat kontroller. Exempelvis kan man använda oinfekterade celler eller celler som smittats med en låg MOI som surrogat positiv kontroll för att identifiera gener som minskar spridningen på knockdown. För att identifiera gener som förbättrar spridningen på knockdown, kunde en infektera celler med en utspädning rad virus och använda brunnar med maximal signalen som surrogat positiv kontroll.

Urval av hits för sekundär skärm validering och vilken teknik att anställa är en annan sak som kräver noggrann överläggning. Kandidaterna väljs vanligen för sekundär skärm validering baserat på omfattningen av hit, på huruvida de betydligt modulera spridning i flera cancer cellinjer (om primära skärmar genomfördes i flera cellinjer) och på biologiskt intresse. Bioinformatiska verktyg såsom DAVID22,23, PANTHER24, sträng25 och PINdb26 kan hjälpa isolera vägar och träffar av biologiskt intresse. Mercer o.a. 8 beskriver användningen av öppen källkod bild analys programvara och har också gjort tillgängliga en algoritm som de utvecklat för visualisering och analys av hits. En faktor att beakta vid tolkningen av resultaten är att nedtystning kan ha olika effekter beroende på Stadium i livscykeln för viruset att utreds. Det är exempelvis möjligt att Nedslagning av en gen tidigt i livscykeln kan hämma virusreplikation, medan knockdown i ett senare skede kan öka replikering. Ofta utförs sekundär skärmar med siRNA från en annan leverantör med olika fröblandningar regioner med flera siRNAs per genen. Dock kan kompletterande tekniker inriktning kandidatgener vara anställd såsom CRISPR-Cas9 eller lentivirus vektorer uttrycker shRNA.

Analysmetoden är också en kritisk fråga. Vi föreslår här med den robusta Z-poängen eller galna20,27 med föreslog cut-off för träff kallelse > 2 eller < -2. Cut-off kan ökas eller minskas beroende på om fokus är på att eliminera mer falsklarm eller fånga mer falska negativa. I en nyligen hög genomströmning skärm med vaccinia virus9fastställdes exempelvis lägre cut-off -1,5 (ingen övre cut-off beskrevs som fokus var på att identifiera gener som minskade spridningen på knockdown). Det finns också andra metoder som kan användas inklusive z-poäng, SSMD (strikt standardiserade Genomsnittlig skillnad) och B Poäng20,28,29,30. Barrows et al.31 jämfört träfflistor som genereras av summan rang, MAD, z-Poäng och SSMD och hittade varje analysmetod resulterade i olika träfflistor. I sin helhet, finns det ingen perfekt metod eller cut-off. Slutligen bekräftar sekundär skärm validering och tertiär valideringsstudier sanna träffar.

Metoden för att filtrera ut cytotoxiska träffar måste också beaktas. Ett sätt är att genomföra primära skärmar i parallella plus eller minus virus. Detta möjliggör detektering av siRNAs som är cytotoxiska på egen hand. Detta var vår strategi i vår Maraba virus skärmar15. Detta är dock inte ofta praktiska. Kanske är en mer praktisk metod, förutom att vara robust, att fastställa träffar som är cytotoxiska som en del av sekundär skärm validering, speciellt om ens fokus är att identifiera träffar att minska replikering vid knockdown. Exempelvis i en hela genomet primära skärm med myxomavirus, Teferi et al. 11 identifierat 1 588 siRNAs som minskade virusreplikation vid knockdown. För att filtrera bort cytotoxiska siRNAs, genomförde de en sekundär cytotoxicitet skärm med dessa siRNAs; de mäts cell livskraft 72 h efter transfection med en resazurin-baserade cell livskraft-analys. Cytotoxiska siRNAs identifierades baserat på en Z-score ≤-1.96. En annan metod är att helt enkelt filtrera bort cytotoxiska siRNAs från primärscreening data baserat på en minskning av antalet celler med en viss procentsats, exempelvis genom en minskning > 50% som Sivan o.a. 9, eller baserat på en viss poäng som Lee et al. 14. i sin studie av värd faktorer krävs för vesikulär stomatit virusreplikation, uteslutna de siRNA träffar som minskar cellernas viabilitet av > 3.0 standardavvikelser från medelvärdet. Det genomsnittliga antalet celler bestämdes baserat på Hoechst färgningen av cellkärnor och, även om inte uttryckligen anges, medelvärdet beräknades till synes på basis per plåt eftersom det är uppenbart att genomsnittliga GFP signal beräknades på grundval av per tallrik.

En begränsning av någon hög genomströmning RNAi skärm är frekventa antalet falska positiva och negativa, som kan komma till följd av assay design, den teknik som används eller genom systematiska fel. Till exempel ett protein kan märkbart påverka replikeringen av viruset, men den tid som valts för nedtystning kan vara för kort ges proteinets halveringstid att upptäcka dess effekt som leder till en falsk negativ enligt assay design. Det är väletablerat att ofullständig knockdown och off-target effekterna av siRNA teknik kan också införa falska positiva och negativa. Systematiska fel, såsom det kant effekt32, kan generera missvisande resultat också. Här kan signalen i de yttre brunnarna i plattan vara systematiskt högre eller lägre än resten av plattan på grund av avdunstning. Det finns strategier till adress några av dessa frågor bland annat: minskar koncentrationen av siRNA att minska off-target effekter33, omkonfigurering plattan layouter för att fylla yttre brunnarna med media för att mildra effekten kant eller anställa beräkningsmetoder som har utvecklats för att upptäcka och motverka systematiska fel såsom kant effekt32,34,35. En allmän metod för att ta itu med falska positiva är att bedriva en sekundär skärm efter den primära skärmen. Som ett sätt att handskas med falska negativa, kan man koppla cut-off för hit ringer och inkluderar potentiella falska negativa för sekundära screening. Detta kommer naturligtvis inte fånga falska negativa som är långt under cut-off. Primära skärmar bör också utföras i två eller tre exemplar att begränsa falska resultat. Slutändan, oavsett vilka strategier är anställda, ingen hög genomströmning skärm identifierar uttömmande alla sanna träffar, men det kan ge en guldgruva av data som en är sannolikt att bryta några värdefulla hits som kan aktiveras på.

I detta protokoll beskrev vi användningen av klädd siRNA och shRNA teknik, men ett annat alternativ är att använda poolade shRNA och CRISPR-Cas9 bibliotek. Poolade shRNA bibliotek var anställd i den Workenhe o.a. 12 studie beskrivs i inledningen. Poolade CRISPR-Cas9-teknik har använts för att genomföra genomet-skala skärmar för att identifiera värd faktorer krävs för replikering av virus såsom Zika virus36, West Nile virus37,38, denguefeber virus39 och hepatit C virus39. Fördelen med att använda poolade bibliotek är att de är billigare för att köpa, inte kräver specialiserad infrastruktur (t.ex. vätskehantering enheter, hög-innehåll Mikroskop och robotliknande utrustning), inte heller har de höga kostnaderna för drift och upprätthålla denna infrastruktur, och de kräver färre förbrukningsartiklar. Nackdelen är att typerna av avläsning är mer begränsad. I de flesta om inte alla poolade bibliotek värd-virus interaktion skärmar hittills är utslaget cellviabilitet eller bristen därav; en kan inte lätt probe för mer komplexa fenotyper. Valet av format beror på den biologiska fråga som ställs.

Framsteg inom genetisk screening teknik under de senaste decennierna att första aktiverade skärmar i bakterier och jäst till nu dagens genomet-skala skärmar i mänskliga celler har öppnat dörren på vid gavel för upptäckt inom olika studieområden. Dessa genetiska skärmar har inte bara tillät oss att besvara grundläggande biologi, men har gett oss nycklar till låsa upp insikter i utveckla och förbättra biotherapeutics. Medan det finns fortfarande lärdomar och utmaningar som måste övervinnas med denna teknik, varit har resultaten hittills spännande. Upptäckterna kommer sannolikt ännu större som romanen screening teknik inklusive CRISPR-Cas9 bibliotek, mikrofluidik och i vivo screening teknik fortsätter att mogna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag från Ontario Institute för cancerforskning, Stiftelsen Kanada för Innovation, Stiftelsen Ottawa regionala Cancer och Terry Fox Research Institute. K.J.A. stöddes av Vanier Kanada Graduate stipendium, en kanadensisk Institute for Health Research-Master's Award, och en Ontario Graduate stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
siRNA library GE Dharmacon G-005005-02
Corning 384-well plate Corning 3985
Falcon 384-well plate Becton Dickinson 353962
Water Sigma W4502
siGenome SMARTpool PLK1 GE Dharmacon M-003290-01
AllStars Negative Control siRNA Qiagen SI03650318
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 GE Dharmacon D-001206-14-20
DMEM/HIGH Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30022.01
Fetal Bovine Serum Sigma F15051-500ML
HEPES solution (1M) Sigma H3535-100ML
Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 2500056
DPBS/Modified GE Healthcare Life Sciences SH30028.02
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778100
Oligofectamine Thermo Fisher Scientific 1225011
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 22600-050
Resazurin sodium salt Sigma R7017-5G
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H21492
Formaldehyde (37% by weight) Fisher Scientific F79-4
500 ml bottles Corning 430282
Adhesive Sealing Film For Microplates Excel Scientific 361006007
Peelable Heat Sealing Foil Thermo Fisher Scientific AB-3720
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette Fisher Scientific 11-120-625
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MicroFlo Select (liquid dispenser) Fisher Scientific 11120621
BioTek Synergy HT plate reader Biotek N/A
Opera Imaging and Analysis Instrument PerkinElmer HH10000115
KiNEDx Robotic Arm Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) KX-300-660
Cytomat 24C Series Automated Incubator Thermo Fisher Scientific 50080227
JANUS Automated Workstation PerkinElmer AJI4M01
Plate Carousel Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) N/A
Alps 3000 plate sealer Thermo Fisher Scientific AB-3000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
  2. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
  3. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
  4. Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
  5. Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
  6. Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
  7. Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
  8. Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
  9. Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
  10. Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).
  11. Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
  12. Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
  13. Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
  14. Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
  15. Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
  16. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
  17. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
  18. Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
  19. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
  20. Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  23. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  24. Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
  25. Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
  26. Luc, P. -V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
  27. Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
  28. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  29. Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
  30. Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
  31. Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
  32. Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
  33. Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
  34. Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
  35. Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
  36. Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
  37. Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
  38. Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
  39. Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).

Tags

Cancerforskning fråga 134 onkolytisk virus RNAi skärm hög genomströmning cancer vaccinia rhabdovirus cell värd funktionsgenomik
Genome-wide RNAi Screening att identifiera värd faktorer som modulerar onkolytisk Virus terapi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, … More

Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, S. D., Lefebvre, C. A., Stojdl, D. F. Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy. J. Vis. Exp. (134), e56913, doi:10.3791/56913 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter