Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Genome-wide RNAi Screening at identificere vært faktorer, at modulerer Oncolytic Virus terapi

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/56913
Automatic Translation
1,2, 1,4, 1, 1, 1,2,3
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Summary

Her beskriver vi en protokol for at ansætte høj overførselshastighed RNAi screening at afdække vært mål, der kan manipuleres til at forbedre oncolytic virus terapi, specielt rhabodvirus og vaccinia virus behandling, men det kan være let tilpasses til andre oncolytic virus platforme eller for at opdage vært gener, at modulere virus replikering generelt.

Abstract

Høj overførselshastighed genome-wide RNAi (RNA interferens) screening teknologi har været meget anvendt til at opdage vært faktorer, der påvirker virus replikering. Her præsenterer vi anvendelsen af denne teknologi til at afdække vært mål, som specifikt modulerer replikering af Maraba virus, en oncolytic rhabdovirus og vaccinia virus med mål at forbedre terapi. Mens protokollen er blevet testet til brug med oncolytic Maraba virus og oncolytic vaccinia virus, denne fremgangsmåde er gældende for andre oncolytic virus og kan også udnyttes til at identificere vært mål, at modulerer virus replikering i pattedyrsceller i generelle. Denne protokol beskriver udviklingen og valideringen af en analyse for høj overførselshastighed RNAi screening i pattedyrceller, centrale overvejelser og forberedelsestrin vigtigt for at gennemføre en primær høj overførselshastighed RNAi skærm og en trinvis vejledning til gennemføre en primær høj overførselshastighed RNAi skærm; Derudover beskriver det bredt metoder til at foretage sekundær skærm validering og tertiære valideringsundersøgelser. Fordelen ved høj overførselshastighed RNAi screening er, at det tillader en at katalogisere, i en omfattende og upartisk måde, vært faktorer, som modulerer ethvert aspekt af virus replikering, kan man udvikle en in vitro- assay som smitteevne, brast størrelse, og cytotoksicitet. Det har beføjelse til at afdække biotherapeutic mål uforudsete baseret på aktuelle viden.

Introduction

Høj overførselshastighed genome-wide RNAi screeningen har vist sig for at være et uvurderligt værktøj for afslørende biologiske indsigt i forskellige områder af undersøgelse, herunder virus biologi. Over det seneste årti eller deromkring, har talrige grupper gennemført cellebaserede storstilet RNAi screening for at udstrakt grad identificere vært gener, at modulerer virus replikation (anmeldt i1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). interessant, et stort antal af disse skærme er blevet ført i kræftceller og flere med vira, der er aktuelle oncolytic virus kandidater herunder vaccinia virus8,9,10 , Myxom virus11, herpes simplex virus12, vesikulær stomatitis-virus13,14, og Maraba virus15. Mens størstedelen af disse undersøgelser fokuserede på at identificere vært faktorer, der påvirker nogle aspekter af virus replikering og ikke identificerer biotherapeutic mål for at øge oncolytic virus terapi, kunne værdifulde data udvindes fra disse datasæt i denne henvisning. Det er klart, at den kraftfulde potentiale til at identificere vært mål, der kan manipuleres til at forbedre oncolytic virus terapi ikke er blevet fuldt udnyttet.

En overflod af oncolytic virus platforme testes i øjeblikket i prækliniske og kliniske undersøgelser herunder herpes simplex virus, reovirus og vaccinia virus, som har haft påviselige succes i sene kliniske forsøg. For fleste af disse platforme, har indsats været rettet mod at ændre virus genomer at forbedre terapi. For eksempel, for at øge tumor specificitet, er specifikke virus gener blevet slettet eller muteret betydeligt begrænser virusreplikation i normale celler, men ikke i tumorceller. I nogle tilfælde transgener er blevet tilføjet som GM-CSF (granulocyt makrofag koloni-stimulerende faktor) til at forstærke immunresponset eller NIS (natrium Iodid symporter) til at aktivere in vivo billeddannelse og cellulære radioiodide optagelse terapeutisk formål. Der har dog været meget lidt arbejde fokuseret på at manipulere vært/tumor gener og udforske virkningen af host/tumor gener på oncolytic virus replikering. Med fremkomsten af high throughput screening teknologi, er det nu muligt at sonde vært-virus interaktioner i genom skala og afkode muligheder for at manipulere vært genom for at forbedre oncolytic virus terapi (gennemgik i16, 17,18).

Vi rapporterede den første undersøgelse demonstrerer proof-of-concept for at bruge høj overførselshastighed genetisk screening for at identificere vært mål, at kunne manipuleres til at forbedre oncolytic virus terapi. For at opdage vært gener, at modulerer Maraba virus oncolysis, en oncolytic rhabdovirus i øjeblikket bliver testet i fase I og II forsøg, vi gennemførte genome-wide RNAi skærme på tværs af tre forskellige tumor cellelinjer i to eksemplarer med en siRNA (kort blander RNA) biblioteket målretning 18,120 gener15. Sti analyse af hits identificeret i skærmene viste berigelse af medlemmer af den ER (endoplasmatiske reticulum) stress reaktion veje. Vi har valgt 10 hits inden for disse veje for sekundære validering ved hjælp af siRNA med forskellige målretning sekvenser fra dem af den primære skærm. Som en del af tertiære validering, gennemførte vi en redning eksperiment med IRE1α (inositol-kræver enzym 1 alpha) til at bekræfte, at ramt var på målet. In vitro og i vivo test ved hjælp af en lille molekyle hæmmer af IRE1α resulterede i drastisk forbedret oncolytic effektivitet.

Workenhe et al. 12 har også gennemført en genome-wide RNAi skærmen ved hjælp af en samlet lentiviral shRNA (kort hårnål RNA) bibliotek målretning 16,056 gener for at identificere vært faktorer begrænser den menneskelige herpes simplex virus type 1 (HSV-1) mutant KM100-medieret oncolysis af brystkræft kræftceller. I den primære skærm identificeret de 343 gener knockdown af som fører til øget cytotoksicitet af KM100-inficerede celler over mock-inficerede celler; de udvalgt 24 af disse gener for sekundære validering. Ud af de 24 gener, 8 gener blev bekræftet i den sekundære skærm med en af dem er SRSF2 (Serin/arginin-rige splejsning faktor 2), som efterfølgende blev bekræftet ved hjælp af en genetisk rescue eksperiment under tertiære validering. Gruppen fortsatte med at identificere en DNA topoisomerase hæmmer kemoterapeutiske at reduceret fosforylering af SRSF2 og viste, at kombinationsbehandling af HSV-1 KM100 med dette hæmmer fører til forlænget overlevelse af TUBO tumor-bærende mus.

I de ovennævnte undersøgelser fulgte en lignende arbejdsproces. Hver begyndte med en primær genome-wide RNAi skærmen efterfulgt af en sekundær skærm på et udvalgt antal af hits identificeret i den primære skærm. Dette blev efterfulgt af tertiære valideringsundersøgelser, som omfattede bekræfter, at ramt var på mål ved at udføre genetiske redde forsøg in vitro med ultimative validering udføres ved at manipulere target gen produktet in vivo. I denne artikel give vi først en generel protokol til udvikling og validering af en høj overførselshastighed siRNA-screening assay, som indebærer fastsættelse af optimale Transfektion betingelser, mængden af virus, og længden af infektion. Vi tilbyder også en detaljeret protokol til at foretage en primær en høj overførselshastighed siRNA skærm samt en samlet beskrivelse af metoden til udførelse af sekundær skærm validering og tertiære validering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. udvikling og validering af en høj overførselshastighed siRNA screening assay

Bemærk: For alle eksperimenter, brug Hepes-buffered vækst medier hensigtsmæssigt for hver cellelinje. Se figur 1 for en oversigt over arbejdsproces fra assay optimering til tertiær validering.

  1. Bestemmelse af de optimale Transfektion betingelser
    1. Vælg en tumor cellelinje eller ideelt set flere tumor celler linjer til at optimere Transfektion betingelser (f.eks. 786-O, NCI-H226, SF268, U373, OVCAR-8, U20S, og se diskussion for mere om udvælgelse af cellelinier).
    2. Vælg en Transfektion reagens eller flere til at teste. Det kan være nødvendigt at teste flere Transfektion reagenser, som nogle kan være giftige eller mere effektivt end andre i en given cellelinje. Også, Husk på at nogle kan have indflydelse på virusinfektion eller kan generere høje baggrund signal på imaging.
    3. Beslutte på positive [e. g. siRNA målretning PLK-1(Polo Like Kinase 1) mRNA, som inducerer celledød] og negative Transfektion kontrolelementer (f.eks. ikke-targeting siRNA).
    4. Følg omvendt Transfektion protokol for den særlige Transfektion reagens, men variere mængden af Transfektion reagens (f.eks. 0.05, 0.1, 0,15 og 0,2 μL/brønd) og celle såning tætheder (f.eks. 625, 1250, 2500 celler/brønd). Omfatter replikater af følgende betingelser: ubehandlet celler, falsk transfekteret celler (dvs. celler plus Transfektion reagens) og transfekteret med positive og negative Transfektion kontrol siRNA-celler (Se figur 2A en prøve plade layout).
      1. I almindelighed, forberede en endelig koncentration i brønden på 10 80 nM fortyndinger af hvert siRNA nM (afhængigt af biblioteket, en højere koncentration af siRNA kan være påkrævet). Medmindre andet er angivet, fortyndes siRNA med Transfektion reagens fortyndingsmiddel. Tilberedes fortyndinger af Transfektion reagens.
      2. Med pipette overfoeres 5 μl af siRNA pr. brønd efterfulgt af 5 μl fortyndede Transfektion reagens. For at lette dette trin, distribuere langs en kolonne i en U-bunden 96-brønd plade, siRNA blander og siRNA fortyndingsmiddel alene (for ubehandlet og mock transfekteret celler). Fordele langs en anden kolonne, fortyndede Transfektion reagens og Transfektion reagens fortyndingsmiddel alene (for ubehandlede celler).
        1. Ved hjælp af en elektronisk pipette, afpipetteres 5 μL/brønd af indholdet af den første kolonne, der indeholder siRNA eller siRNA fortyndingsmiddel i de tilsvarende wells af 384-godt plade efterfulgt af 5 μL/brønd af fortyndede Transfektion reagens eller Transfektion reagens fortyndingsmiddel fra den anden kolonne.
      3. Centrifugeres plader på 1026 x g i 1 minut ved stuetemperatur, og Inkuber i tiden ordineret til Transfektion reagens (f.eks. 5-20 min).
      4. Mens pladerne inkubere, forberede celle suspensioner af forskellige tætheder. Med pipette overfoeres 30 μL af cellesuspension pr. brønd. Før du placerer pladerne i rugemaskinen, lad pladerne sidde i 45-60 min. ved stuetemperatur til at tillade den ensartet afregning af celler19.
        Bemærk: Hvis inkubationstiden ordineret til Transfektion reagens med siRNA er korte, forberede celle suspensioner før inkubation.
      5. Der inkuberes i 48-72 h afhængigt af den ønskede længde af knockdown valgt for skærmen.
    5. Forbered en fastsættelse og farvning løsning bestående af formaldehyd, Hoechst 33342 og PBS (fosfatbufferet saltopløsning) til en endelig koncentration i hver brønd på 4% formaldehyd og 5 ug/mL af Hoechst 33342. Efter behov, prøv en højere (f.eks. 7,5 ug/mL) eller lavere koncentration (f.eks. 2 ug/mL) af Hoechst hvis signalet er for svagt eller for stærk, henholdsvis.
    6. Undvære 30 μL af fastsættelse og farvning løsningen direkte i alle brønde. Inkuber plader i 30 minutter ved 37 ° C. Gemme plader ved 4 ° C. Hvis du bruger en ikke-Konfokal mikroskop, vaske pladerne med PBS ved hjælp af en plade skive; i de fleste tilfælde er vask unødvendig, når ved hjælp af en Konfokal mikroskop.
    7. Udvikle et script til at opgøre antallet af celler pr. brønd.
      Bemærk: Der findes flere softwarepakker til dette formål, og mens de kan have forskellige måder at generere scripts, de alle generelt har et middel til at identificere kerner, celler og områder af interesse samt beregning af intensitet og morfologiske egenskaber. Når de udvikler en screening script, er det vigtigt at overveje den tid, det tager at køre scriptet pr. plade og måske inddrage kun væsentlige målinger for at minimere behandlingstid. For eksempel, for at kvantificere celle nummer, kan man beregne området Hoechst pr. brønd over en angivet intensitet; og for at kvantificere virus spredning, kan man beregne området normal god landbrugspraksis (grøn fluorescerende proteiner) pr. brønd over en angivet intensitet. Scriptet "pared ned" skal være i forhold til den mere omfattende script til at sikre, at ingen væsentlige oplysninger er tabt.
    8. Analysere resultaterne for at fastlægge de optimale Transfektion betingelser, der er Transfektion reagens beløb og cellen såning tæthed, der resulterer i betydelig celledød (0-30% celle overlevelse) og er minimalt giftigt for celler (f.eks. 90-100% celle overlevelse). Bemærk: Det kan tage længere tid at observere celle død fænotype i cellelinjer med lange fordobling gange. Se figur 2B og 2 C til repræsentative resultater. Også sikre, at cellerne transfekteret med ikke-targeting siRNA er ca 90-100% sammenflydende på tidspunktet for fiksering, som senere vil man ønsker at inficere celler, der er i denne confluency.
  2. Bestemmelse af den optimale mængde virus og længden af infektion
    1. Udføre de samme omvendt Transfektion trin som beskrevet ovenfor (Se 1.1.4.1 til 1.1.4.4); men brug kun de optimale Transfektion betingelser (Se 1.1.8) (f.eks. til 786-O celler: 1500 celler/brønd og 0,05 μL/brønd af RNAiMAX) og desuden indeholde ekstra brønde er inficeret med virus [fx brønde med ubehandlede celler, mock transfekteret celler, celler transfekteret med ikke-targeting siRNA, og celler transfekteret med positive virus kontrol, hvis dem er kendt (dvs. siRNA målretning vært gener, der vil hæmme eller styrke replikation)].
      1. Se figur 3A for en prøve plade layout. Der inkuberes i 48-72 h.
    2. Inficere nærmere virus brønde med en oncolytic virus at udtrykke fluorescerende reporter protein (f.eks. normal god landbrugspraksis) med en vifte af multiplicities af infektion (MOIs) (fx 0,001-10; Rækken valgt vil være afhænge af niveauet af resistens eller følsomhed over for linjen celle.). Omfatte ikke-inficerede wells samt. Pipette 40 μl af hver pr. brønd for en endelige mængden af 80 μl. Der centrifugeres hver plade på 400 x g i 30 min. ved stuetemperatur.
    3. Følgende infektion, billede cellerne leve med en høj-indhold, automatiseret mikroskop med jævne mellemrum (f.eks. hver 4-8 h). Se figur 3B og 3 C.
    4. Udvikle et script til at kvantificere virus spredning (f.eks. normal god landbrugspraksis areal pr. brønd) (Se 1.1.7). Analysere billeder og vælge et tidspunkt og et MOI, der giver mulighed for påvisning af stigninger og fald i spredningen. Sikre tidspunkt og MOI henhører under en lineære område at lette påvisning af små ændringer i spredningen. Anslå Z-faktoren (eller Z') for de givne tidspunkt og MOI.
      Bemærk: Anslået Z-faktor = 1-3 (σp + σNielsen) / | μp- μn|, hvor σp er standardafvigelsen af positive virus kontrol og σn er stikprøvens standardafvigelse af virussen negative kontrol; og μp er stikprøvens middelværdi af den positive virus kontrol og μn stikprøvens middelværdi af de negative kontroller. En anslået Z-faktor på 0,5 - 1,0 er anses for at være en fremragende analyse og egnet til screening20,21.
    5. Bekræfte, at negative virus kontrol siRNA har ingen indvirkning på virus replikering ved at sammenligne den forlorne transfekteret og ubehandlet brønde. Det er ofte nødvendigt at teste flere negative kontroller som nogle negative siRNA kontrolelementer kan have indflydelse på virus replikering.
  3. Endelige validering af high throughput screening analysen
    1. Gentag trin 1.2.1 og 1.2.2 ovenfor, men kun denne gang inficere celler med den optimale MOI. I stedet for live imaging, fix og plette pladen (som beskrevet i 1.1.5 og 1.1.6) på det optimale tidspunkt (Se 1.2.4).
    2. Billede på pladen. Analysere resultaterne ved hjælp af det samme script, der vil blive brugt til skærmen (Se 1.1.7 og 1.2.4). Bekræfte Transfektion betingelser (dvs. god knockdown i wells transfekteret med positive Transfektion kontrol og minimal toksicitet i wells transfekteret med negative Transfektion kontrol). Anslå Z-faktoren for at bestemme robusthed i analysen (Se 1.2.4).
  4. Yderligere undersøgelser og overvejelser for at gennemføre høj overførselshastighed screening
    1. Afprøve holdbarheden af mikrotiter plader, som nogle plader kan knække under centrifugering, især når låg holdes og flere plader er centrifugere på én gang. At reducere revner, centrifugeres uden låg (forudsat pladerne har sæler), eller reducere antallet af plader centrifugeres pr. spand.
    2. Teste stabilitet af Transfektion reagens mix over tid. Når Transfektion reagens er føjet til pladerne, kan der være en betydelig forsinkelse før tilsætning af celler; Det er derfor vigtigt at kende tidsperioden som Transfektion reagens mix forbliver effektive. For skærmen, kan det være nødvendigt at forberede celler før tilføje Transfektion reagens mix til pladerne.
    3. Forberede til at bruge den flydende dispenser. Bestemme de mængder, der kræves for at give afkald på Transfektion reagens, celler, virus, og fastsætte under hensyntagen til omfanget at slangen ventepositioner, volumen tabte til pre udlevering (hvis enheden har denne funktion) og residualvolumen kræves i flaskerne bruges til udlevering.
      1. Indstille og teste de programmer, der vil blive brugt til udlevering Transfektion reagens, celler og virus. For at minimere tabet af Transfektion reagens, grænse, hvis det er muligt, antallet af pre dispenserer. Etablere en protokol til at kalibrere den flydende dispenser og teste dens nøjagtighed og præcision.
    4. Forberede bulk udlevering af Transfektion reagens, celler og virus
      1. Første bestemme antallet af plader skal behandles i én batch i betragtning af antallet af plader af celler, der realistisk kan være trypsinized på én gang, antallet mikrotiter plader, der kan centrifugere på én gang, længden af tid, der kræves til at behandle én batch af plader med den flydende dispenser, og også den nødvendige tid til billedbehandling. Bemærk: Generelt, forarbejdning ca 30 plader ad gangen er helt realistisk og behandling 3 partier af plader er overskueligt på én dag.
      2. Empirisk kontrollere mængden af Transfektion reagens kræves til at behandle én batch af plader. Test, dette volumen er tilstrækkelig ved udlevering 5 μl af destilleret vand flere gange på tværs af en plade det tilsvarende antal gange, der vil være forpligtet til at behandle én batch.
      3. For at sikre en jævn fordeling af celler, anslå den nødvendige tid til dispensere celler på tværs af en batch af plader. Forberede en flaske, der indeholder mængden af celler til en batch, og dispensere cellerne i flere kolonner i en plade ad gangen, med jævne mellemrum i samme løbet af tid, det tager at give afkald på tværs af en batch af plader. Test hvor ofte vil det være nødvendigt at blande celler for at opretholde en jævn fordeling af celler.
      4. For at sikre en jævn fordeling af virus, Gentag den samme procedure som ovenfor (Se 1.4.4.3), men denne gang udlevering virus på sammenflydende brønde. Hvis virus ikke er jævnt fordelt, overveje at forberede virus i koniske rør og vortexing hver tube inden udlevering.
    5. Spore væksten af celler til at bestemme tidslinjen for vokser nok celler for skærmen. Også, bestemme det gennemsnitlige antal celler, der kan høstes pr. plade af celler vokser i log fase for at være i stand til at estimere antallet kræves for skærmen.
  5. Endelige forberedelsestrin for high throughput screening
    1. Op til en måned før påbegyndelse screening, afgøre alle de materialer, der er nødvendige for skærmen. Bestil eventuelle nødvendige reagenser (Se materialer). Sikre den nødvendige mængde af virus er på hånden (helst, bruger den samme bestand, der blev brugt under optimering.).
    2. Op til to uger før påbegyndelse screening, tø op og vokse op de celler, der kræves for skærmen. Sikre tilgængeligheden af centrifuge og firkantede centrifuge spande.
    3. I løbet af ugen før påbegyndelse screening, forberede medier flasker til reverse Transfektion og infektion, en bestand af 70% ethanol, 2 X Transfektion reagens fortyndingsmiddel (f.eks. 2 X Opti-MEM), hvis nødvendigt (f.eks. Hvis biblioteket siRNA er fortyndet i RNase-free vand, man gerne vil bruge 2 X til transfect celler), og delprøver af virus (én pr. parti af plader). Kontrollere tilstanden af cellerne.
      1. Forberede en stamopløsning af Hoechst 33342 pletter (f.eks. 5 mg/mL). Forberede en balance plade, hvis man vil være nødvendig for centrifugering.
      2. Sikre plade vaskemaskinen er i god orden, hvis det skal bruges. Sikre den flydende dispenser er korrekt kalibreret og udlevering nøjagtigt og præcist. Også sikre, at programmerne er korrekt angivet på den flydende dispenser.

2. gennemføre skærmbilledet primære høj overførselshastighed

Bemærk: Før påbegyndelse RNAi skærmen, mikrotiter plader (f.eks. 384-godt plader) nødt til at være klædt med siRNA bibliotek og screening kontrol. Følgende trin udføres bedst af to personer med én person (dvs. Person A) er primært ansvarlig for udlevering Transfektion reagens og celler på tværs af pladerne, og den anden person (dvs. Person B) er ansvarlig for centrifugering plader umiddelbart før Transfektion og for at forberede cellerne. Inkluderet i parenteser er noget specielt for at behandle én batch af 33 plader (dvs. halvdelen af biblioteket) med linjen 786-O celle.

  1. Forberedelse til reverse Transfektion
    1. Person A: sted nok medier, trypsin og PBS nødvendigt at behandle én batch af plader i et 37 ° C vandbad. Valgfrit: Trypsinize en plade af celler, og tæller antallet af celler pr. plade for at levere en real-time skøn over antallet af plader kræves pr. parti.
    2. Opnå en batch af plader (f.eks. 33 plader) fra fryseren og vent 20-30 min for at tillade plader til optøning. Mens pladerne optøning, fortsætte med følgende trin.
      1. Person A: pipette til 50 mL konisk rør mængden af Transfektion reagens fortyndingsmiddel, der er nødvendige for at behandle én batch af plader (f.eks. 2 x 37.125 mL) og placere dem i et 37 ° C vandbad. Fylde to flasker med 70% ethanol (f.eks. 250-500 mL flasker). Fylde to 50 mL konisk rør med PBS og en med destilleret vand.
      2. Person A: fordybe flydende dispenseren slanger ind i en flaske af 70% ethanol. Hvis alle tips ikke vil anvendes til udlevering Transfektion reagens (f.eks. hvis de ydre pladens huller ikke bliver brugt), frigøre den unødvendige slanger først. Placer et stykke malertape omkring slangen til at markere det punkt, under hvilket slangen kan betragtes som sterile. Prime med ca. 25 mL. Hæld yderligere ethanol i flasken til at erstatte de tabte bind. Lad slangen sidder i ethanol i mindst 5 min.
      3. Person B: Forbered trypsinize celler. Spray vævskultur (TC) hætte med 70% ethanol. Spray og placere de nødvendige pipets, tips, flasker og mikrofuge rør for at forberede celler i hætten (Se 2.2.1.1 og 2.2.1.2). Der centrifugeres de forseglede plader i sæt ved 1026 x g i 2 min. ved stuetemperatur. Fjern låg fra plader i en TC hood, hvis tidligere bestemt, at pladerne kan knække under centrifugering når lågene holdes (Se 1.4.1).
    3. Person A: Fjern forseglingen fra pladerne. Før, under eller efter sæler er blevet fjernet (afhængigt af længden af inkubation kræves), pipette den nødvendige mængde af Transfektion reagens (f.eks. 375 μL/rør til en endelig koncentration på 0,05 μl RNAiMAX/brønd) i de koniske rør indeholdende pre varmede Transfektion reagens fortyndingsmiddel (f.eks. 37.125 mL/tube).
    4. Mix af pipettering op og ned 10 gange. Inkuber ved stuetemperatur i den tid, der er foreskrevet for Transfektion reagens anvendes (f.eks. 0-10 min).
  2. Omvendt Transfektion
    1. Har Person B fuldføre følgende opgaver.
      1. Begynd trypsinizing celler (f.eks. 3 plader af 786-O celler). Opsug medier fra hver plade. Skyl med 9 mL PBS. Med pipette overfoeres 3 mL trypsin pr. plade. Der inkuberes ved 37 ° C for ca 5 min. Resuspend celler med 22 mL af medier. Med pipette overfoeres op og ned 10 gange.
      2. Kombinere cellesuspension fra hver vævskultur plade i en steril flaske. Bland cellesuspension af invertere. Afpipetteres 1 mL alikvoter af cellesuspension ind i to separate mikrofuge rør. Fjerne en prøve fra hver mikrofuge tube og tælle cellerne. Beregning af volumen af cellesuspension kræves for tætheden kræves (fx 1500 celler/brønd), og forberede nok fortyndet cellesuspension (f.eks. 500 mL) at give afkald på tværs af en batch af plader.
    2. Har Person A fuldføre følgende opgaver parallelt til Person B.
      1. Tomme flydende dispenseren slanger af ethanol. Prime slanger med ca. 25 mL PBS, og derefter tømme slangen. Vær forsigtig ved omgangen med slangen for at sikre, at del af slangen under malertape, der vil være nedsænket i Transfektion reagens og senere i en cellesuspension holdes sterilt. Sæt fra hinanden plader, som sikkert kan gøres med en koniske rør af Transfektion reagens løsning.
      2. Med pipette overfoeres Transfektion reagens løsninger op og ned 10 gange. Prime slanger med Transfektion reagens løsning. For at minimere tabet af Transfektion reagens, prime med lige nok løsning til knap klare tips. Vælg det korrekte program på den flydende dispenser og dispensere 5 µl Transfektion reagens pr. brønd.
        Forsigtig: Nøje at overvåge niveauet af Transfektion reagens så at det er genopfyldes inden det løber ud. Færdiggørelsen af de plader, der er sæt apart bør give en køindikator for at tilføje flere Transfektion reagens løsning.
      3. Der centrifugeres plader på 1026 x g i 1 minut ved stuetemperatur. Denne gang bliver der låg på, så kan det være nødvendigt at centrifugeres mindre plader ad gangen for at undgå revner (f.eks. 2 plader pr. spand). Inkuber plader ved stuetemperatur i tiden ordineret til Transfektion reagens anvendes (f.eks. 10-20 min).
      4. Under inkubation, tømme slangen af Transfektion reagens løsning, og læg det i en fuld 50 mL konisk slange der indeholder PBS. Skyl slanger med ca. 25 mL PBS af priming og tømning.
        1. Hvis flere af tips skal bruges til udlevering celler end blev brugt til udlevering Transfektion reagens, Re-vedhæfte den ubrugte slanger, og igen sterilisere alle slanger med 70% ethanol før skylning slanger med PBS (jf. 2.1.2.2).
      5. Bland den flaske, der indeholder cellesuspension, når den er udarbejdet. Placere slangen i cellesuspension, og prime nok til at se, at hvert tip udlevering korrekt. Undvære 30 μl pr. brønd af cellesuspension på tværs af alle pladerne. Hvis det er nødvendigt, blandes cellesuspension med jævne mellemrum at undgå afregning.
        Forsigtig: Nogle gange dråber af suspension, der indeholder medier kan klæbe til siderne af tips. Når dette er observeret, Aspirér hurtigst muligt eller tør med fnugfri serviet overhældt med 70% ethanol.
      6. Tømme slangen af cellesuspension. Skyl slanger med ca. 25 mL PBS, efterfulgt af ca. 50 mL destilleret vand.
    3. Tillad plader til at sidde i 45-60 min fra tid af celle såning ved stuetemperatur før han vendte tilbage til plader til rugemaskine. Inkuber plader i en uforstyrret inkubator for den ønskede længde af gene silencing (f.eks. 48 h) (Se 1.1.4.5).
  3. Infektion
    1. For at spare tid, dagen før inficerer cellerne, afpipetteres i sterile flasker det nøjagtige beløb af medier påkrævet at inficere hver batch af plader herunder medier til ikke-inficerede wells (f.eks. 2 x 350 mL og 2 x 50 mL til 33 plader). Desuden teste den flydende dispenser til præcision og nøjagtighed, og hvis det er nødvendigt at kalibrere igen.
    2. Varm medier ved 37 ° C. Fylde to flasker med 70% ethanol, to 50 mL konisk rør med PBS og én med destilleret vand. Kontroller, at centrifugen er ved stuetemperatur.
    3. Sterilisere slanger med 70% ethanol, og skyl med PBS som tidligere beskrevet (jf. 2.1.2.2 og 2.2.2.1). Mens slangen sidder i ethanol, afpipetteres præcise mængden af virus, der kræves i flasken indeholder medier tidligere forberedt på infektion (Se 2.3.1). Skyl slanger med PBS priming med 25 mL og derefter tømme.
    4. Fjerne pladerne fra rugemaskinen, og placere dem i TC hood. Prime slanger med medier. Dispensere 40 μL af medier i de ikke-inficerede kontrolhullerne. Tømme slangen af medier og skyl med 25 mL PBS. (Se 2.2.2.5 forsigtighed)
    5. Efter blanding virus, skal du placere slangen i flasken indeholder virus. Dispensere 40 μl af virus på tværs af pladerne. Der centrifugeres plader i 30 min. ved 400 x g ved stuetemperatur. Returnere pladerne til rugemaskine. Inkuber plader for den tidligere beregnede tidsrum (f.eks. 24 h) (Se 1.2.4).
  4. Fastsættelse og farvning celler
    1. For at spare tid, dagen før fastsættelse, forberede en flaske fastsættelse og farvning løsning som indeholder formaldehyd og PBS (f.eks. 179 mL 37% formaldehyd og 270 mL PBS til en endelig koncentration på 4% formaldehyd) for hver batch af plader, men udelader den Hoechst pletten. Lagre i brandfarlige kabinet fra lys.
    2. Skyl slanger med 70% ethanol og PBS som tidligere beskrevet (jf. 2.1.2.2 og 2.2.2.1). Tilføje den nødvendige mængde af Hoechst (fx. 2,5 mL af en 5 mg/mL af Hoechst til en endelig koncentration i brønden på 7,5 μg/mL) til fastsættelse og farvning løsning og mix.
    3. Undvære 30 μL fastsættelse og farvning løsning på tværs af alle pladerne. Læg pladerne i rugemaskinen i 30 min. Efter inkubation, anvende sæler på pladerne, og gemme plader ved 4° C beskyttet mod lys. Vaske pladerne, hvis nødvendigt (Se 1.1.6).
  5. Billedbehandling og billedanalyse
    1. Billede af plader med en automatiseret, high-indhold mikroskop. Bruge de tidligere beregnede indstillinger, men først teste indstillingerne for at sikre ingen justeringer skal foretages.
    2. Kvantificere normal god landbrugspraksis (eller andre fluorescerende reporter) område og Hoechst areal pr. brønd med den tidligere udviklet script (Se 1.3.2). Test scriptet med en håndfuld af pladerne først til at bestemme, hvis små ændringer skal foretages før partiet analyserer alle pladerne.
    3. Identificere hits. Bemærk: Den robuste Z-score/MAD (median absolutte afvigelse) metode er en metode, der bruges til dette formål. Typisk, snesevis af > 2 eller < -2 er indstillet som cut-offs. Denne metode er bedst bruges når siRNA prøver er tilfældigt fordelt på tværs af pladerne og ikke, for eksempel, grupperet efter funktion som prøverne anvendes som de facto negative kontroller. Filtrere cytotoksiske siRNAS, som disse forventes at formindske ikke-specifikt virus spredes (Se diskussion for yderligere detaljer om frafiltrere cytotoksiske hits).

3. sekundær skærm validering af hits med TRC (The RNAi Consortium) shRNA bibliotek

Bemærk: Se diskussion for detaljer om valg af hits til sekundære validering og mulige screening teknologier. Hvis siRNA teknologi er valgt for sekundære validering, den samme analyse udviklings- og valideringsfase protokol kan bruges som blev brugt til den primære skærm (Se 1).

  1. Få en brugerdefineret TRC shRNA bibliotek målretning kandidat gener af interesse som glycerol bestande.
  2. Forberede Transfektion kvalitet plasmid DNA fra glycerol bestande. Bemærk: En detaljeret protokol (i.e. "shRNA/sgRNA/ORF Glycerol og Plasmid DNA forberedelse") kan findes her: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  3. Producere lentiviruses udtrykker shRNA rettet mod gener af interesse med DNA plasmider. Bemærk: En detaljeret protokol for lentivirus produktion i 96-brønd plader [i.e. "shRNA/sgRNA/ORF High Throughput Viral produktion (96 godt)"] kan findes her: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  4. Inficere celler med lentiviruses. Bemærk: En detaljeret protokol for lentiviral infektion i 96-brønd plader (i.e. "Lentiviral infektion") er tilgængelig online på http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
  5. Inficere celler med oncolytic virus enten følgende valg af puromycin (Se 3.4 for udvalg protokol) med held transduced celler eller umiddelbart efterfølgende transduktion (uden puromycin udvalg). For at bestemme den optimale mængde virus og varigheden af inkubationen med virus, skal du bruge den samme metode anvendes til den primære skærm.

4. tertiære validering

Bemærk: Formålet med tertiær validering er primært bekræfte at hit er på målet, tumor specifikke, og øger effekten in vivo. Man kan også teste om det modulerer spredning på tværs af et spektrum af tumor cellelinjer

  1. Bekræftelse at knockdown af kandidat-genet er på mål
    1. Først bekræfte, at der er en sammenhæng mellem fænotype og genhæmning. Brug den samme analyse, der blev udviklet til skærmen eller ændre det til et 6-godt format at vurdere ekstraudstyr eller hæmning af spredning i et større format. Gennemføre et tidsforløb med celler transfekteret med siRNA målretning molekylærgenetisk interesse plus og minus virus.
    2. Billede af brønde, der indeholder virus-inficerede celler, og indsamle cellelysater fra ikke-inficerede brøndene med regelmæssige tidsintervaller. Afgøre, om der er en sammenhæng mellem genhæmning og ekstraudstyr eller hæmning af spredning. Vurdere genhæmning af kvantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) og/eller Western blotting.
    3. Udføre en genetiske rescue eksperiment for at bekræfte hit er på målet. Bemærk: I en typisk rescue eksperiment, kandidat-genet er slået ned med RNAi mens på samme tid celler er transfekteret forbigående med RNAi resistente cDNA (f.eks. ortholog af genet) udtrykker kandidat genet til at afgøre, om den Fænotypen af genet er restaureret eller "reddet". Stabil cellelinjer overekspression RNAi resistente cDNA af kandidat-gen af interesse kan også være ansat.
    4. Alternativt, i stedet for en genetisk rescue eksperiment, bruge flere ortogonale assays til at bekræfte, at hit på mål [f.eks. bestemme, om den samme fænotype er opnået ved knockdown af target-genet med flere siRNAs på knockdown af target-genet i flere stabile cellelinjer udtrykker shRNA mod målet-genet, og efter knockout med CRISPR (Clustered regelmæssigt interspaced korte palindromiske repeat)-Cas9 teknologi i flere cellelinjer.].
  2. Bekræftelse af, at ramte er tumor-specifik og modulerer spredt over en række tumor cellelinjer
    1. Foretage en tilsvarende analyse som i 4.1.1, men med normale celler og andre tumor cellelinjer.
  3. Bekræftelse at manipulation af kandidat-genet øger effektiviteten i vivo
    Bemærk: Beskrevet nedenfor er tre mulige metoder til at manipulere genet målrette på vivo.
    1. Finde et lægemiddel til at manipulere gen mål. Hvis der er et lægemiddel som en lille molekyle hæmmer, der er rettet mod det samme gen, administrere det med oncolytic virus in vivo. Det er vigtigt at fastslå den optimale timing for forvaltning af stoffet.
    2. Ingeniør virus at hæmme eller overexpress gen mål afhængigt af, om man ønsker at hæmme eller styrke gen mål. For at hæmme gen, ingeniør oncolytic virus for at give udtryk for en dominerende negativ af genet eller at udtrykke shRNA målretning genet. For at forbedre udtryk af genet målet, klon oncolytic virus med en transgen overekspression genet.
    3. Ingeniør cellelinjer med genet bankede-nede eller slået ud med shRNA eller CRISPR-Cas9 teknologi, hhv. Implantat linjen manipuleret celle og wild-type celle linje i vivo og efterfølgende inficere med oncolytic virussen. Bemærk: Denne metode fungerer som en proof-of-principle og kan hjælpe med at afgøre, om investere ekstra tid og ressourcer til at udvikle et lægemiddel til at manipulere gene i vivo, for eksempel, ville være umagen værd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En oversigt over arbejdsgangen for at identificere vært mål for at forbedre oncolytic virus terapi er præsenteret i figur 1.

Som illustreret i figur 1, er den kritiske første skridt til at gennemføre en høj overførselshastighed RNAi skærm assay udvikling. Figur 2A giver en prøve plade layout for Transfektion optimering assay. Figur 2B består af repræsentative billeder af forventede resultater, og fig. 2 c er en repræsentativ plot af de forventede resultater. Efter siRNA knockdown af PLK-1, et gen, der inducerer celledød og kan bruges som positiv kontrol for at overvåge siRNA knockdown effektivitet, man ville forvente celle overlevelse at være mellem 0-30%, medmindre linjen celle har en lang fordobling tid i så fald vil det tage Larsen onger at observere celle død fænotype. Den ikke-targeting siRNA bør også være minimalt giftigt for celler med en lignende relativ overlevelse end ubehandlet celler.

Et andet nøgleelement i assay udvikling er at bestemme MOI til at inficere celler og længden af tid for infektion. Figur 3A giver en prøve plade layout til bestemmelse af mængden af virus og varigheden af inkubationen med virus. Figur 3B skildrer resultaterne af en levende tidsforløb 786-O celler inficeret med vvDD-eGFP (oncolytic vaccinia virus udtryk for forbedrede normal god landbrugspraksis med Thymidine Kinase og Vaccinia vækstfaktor gener slettet) på forskellige MOIs. Repræsentative billeder af celler inficeret med vvDD-eGFP på en MOI på 0,05 er vist i figur 3 c. Baseret på de resultater, der er afbildet i figur 3B, kan man vælge en MOI på 0,05 og en længde på infektion på 21 h som dette vil give mulighed for påvisning af stigninger og fald i udbredelsen som dette tidspunkt er en lineær, og den anslåede Z-faktor på dette ti mig-punkt er 0,6 kohorter, der øger og kohorter, der sænker spredning. Som en del af validering af denne analyse, vil man ønsker at lave celler på denne MOI og tid-point, og beregne Z-faktor.

Efter protokollen beskrevet, gennemførte vi genome-wide RNAi skærme på tværs af tre forskellige tumor cellelinjer (f.eks. OVCAR-8, U373, NCI-H226) i to eksemplarer med en siRNA bibliotek målretning 18,120 gener15. Ved hjælp af metoden gal, identificeret vi 1008 hits fælles for mindst 2 ud af 3 kræft cellelinjer (figur 4A). Sti analyse af hits identificeret i skærmene viste berigelse af medlemmer af den universelle regelmæssige gennemgang (udfoldet protein svar) og ERAD (endoplasmatiske reticulum forbundet protein nedbrydning) veje (figur 4A). Vi har valgt 10 hits inden for disse veje for sekundære validering ved hjælp af siRNA med forskellige målretning sekvenser fra dem af den primære skærm (figur 4B). Som en del af tertiære validering, gennemførte vi en genetiske rescue eksperiment med IRE1α og ATF6α (aktiverende transskription faktor 6 alpha) til at bekræfte, at disse hits var på mål (figur 4 c).

Figure 1
Figur 1: skematisk af arbejdsprocessen til at identificere vært mål for at forbedre oncolytic virus terapi. Det første skridt er at udvikle og validere en analyse for høj overførselshastighed RNAi screening, som omfatter optimering Transfektion betingelser for at indføre siRNA i celler, bestemme det optimale antal virus (dvs. MOI) at inficere celler med og de varighed af inkubationen med virus. Det andet skridt er at gennemføre en høj overførselshastighed genome-wide screen. En siRNA bibliotek rettet mod gener på tværs af det hele genom er klædt på mikrotiter plader. Celler er så omvendt transfekteret med siRNA bibliotek. Efter en 48-72 h inkubationstid at tillade genhæmning, celler er inficeret med den optimale mængde af virus. Efter den optimale længde af inkubationen med virus, er celler fast og plettet, og efterfølgende afbildet med en høj-indhold mikroskop. Efterfølgende billede og data analyse vil bidrage til at identificere gener, der væsentligt modulerer virus replikering, der er benævnt "hits." En sekundær validering skærmen er udført på udvalgte hits fra den primære skærm generelt med siRNA eller shRNA med forskellige frø regioner. Tertiære validering forsøg er udført for at bekræfte at hits på mål, tumor specifikke og forbedre effektiviteten i vivo. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: optimering af Transfektion betingelser for høj overførselshastighed RNAi screening assay. (A) en prøve plade layout for at optimere Transfektion betingelser med to forskellige cellelinjer. (B) repræsentative billeder af 786-O celler (1500 celler/brønd) farves med Hoechst 33342 efter 72 h inkubation Transfektion reagens fortyndingsmiddel alene (dvs. ubehandlet), med Transfektion reagens og fortyndingsmiddel (dvs. mock transfekteret), med ikke-targeting siRNA og med siRNA målretning PLK-1. (C) repræsentative resultater fra Transfektion optimeringseksperiment viser 22% overlevelse af celler transfekteret med PLK-1 siRNA (n = 24) og 94% overlevelse af celler transfekteret med ikke-targeting siRNA (n = 8). Fejllinjer = ± SD, standard afvigelse; skalere barer = 200 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: bestemmelse af mængden af virus og varigheden af inkubationen med virus for høj overførselshastighed RNAi screening assay. (A) en prøve plade layout for at optimere mængden virus og varigheden af inkubationen med virus. Kolonne 1 og 24 indeholder Transfektion kontrol og er venstre inficerede. Kolonne 2 til 23 indeholder ubehandlede celler, mock transfekteret celler og celler transfekteret med positive og negative virus kontrol alle inficeret med en vifte af MOIs startende med ingen virus i kolonne 2 og 3. (B) 786-O celler var omvendt transfekteret med ikke-targeting siRNA og inkuberes i 48 timer. De blev efterfølgende inficeret med vvDD-normal god landbrugspraksis på MOIs angivet og afbildet på 8 h intervaller starter ved 5 timer efter infektionen (hpi). Den gennemsnitlige normal god landbrugspraksis areal pr. brønd (± SD) blev beregnet for hvert tidspunkt (n = 12) og afbildes på grafen. Z-faktor beregnes mellem punkterne A og B er 0,6 og Z-faktor beregnes mellem punkterne B og C er 0,6. (C) repræsentative levende billeder af en brønd, der er inficeret med en MOI på 0,05 på tidspunkter angivet. Forstørrelse, 10 x; 9 felter/godt; skalere barer = 200 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Genome-wide Screen identificerer Skadestuen Stress reaktion blokade som en Potent sensibilisator for Rhabdovirus-medieret Oncolysis. (A) Venn-diagram beskriver antallet overlappende hits af høj overførselshastighed RNAi skærme i 3 tumor cellelinier, og en tabel (+ syntetisk dødbringende;-, ingen interaktion) og skematisk diagram (rammer skitseret i rød) illustrerer centrale hits inden for den universelle regelmæssige gennemgang og ERAD veje. (B) EF50 forskydninger (sorte bjælker, venstre y-akse) blev bestemt for U373 celler behandles med Maraba virus (48 h) efter behandling med siRNA (72 h) rettet mod en række universelle regelmæssige gennemgang/ERAD hits fra skærmen. Relative mRNA udtryk for hvert gen efter siRNA knockdown (72 h) er afbildet i hvid (højre y-akse). (C) celle levedygtighed assays blev udført 48 timer efter Maraba virusinfektion, i U373 celler, der ectopically udtrykker musen ATF6α (eller kontrol normal god landbrugspraksis) ± siRNA målretning menneskelige ATF6α (eller ikke-targeting [NT] kontrol; venstre panel) eller menneskelige XBP1(s) (eller kontrol ) ± siRNA målretning menneskelige IRE1α (eller styre; højre panel). Western blotting demonstrere genhæmning og ektopisk genekspression er vist. EF50 skifter = skift i dosis af virus forpligtet til at dræbe 50% af cellerne; Fejllinjer = ±SD; XBP1(s) = X-box bindende protein 1 (splejset); (B), en-vejs ANOVAs blev udført efterfulgt af en Bonferroni flere sammenligning post hoc test for at udlede p værdier; I (C), blev student's t-test udført for at udlede p værdier; * p < 0,05; #p < 0,05. (Dette tal er blevet ændret fra Mahoney mfl., 201115). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her præsenterer vi en protokol for at ansætte høj overførselshastighed RNAi screening at identificere vært mål, der kan manipuleres til at forbedre oncolytic virus terapi. Dette er blevet testet med succes med oncolytic Maraba virus og oncolytic vaccinia virus, men, som bemærket, det kan tilpasses til brug med andre oncolytic vira eller andre vira generelt for at identificere vært gener, at modulerer virus replikering. Screening protokol er også designet til at identificere gener, at øge eller mindske spredning, men det kan let ændres til andre udlæsninger. Vores skærme med Maraba virus, for eksempel, var designet til at identificere gener modulere oncolysis udnytter et simpelt resazurin-baserede vitale farvestof assay for at score cellernes levedygtighed (Se figur 4)15. I disse skærme, efter inkubation med virus, i stedet for fastsættelse af celler med formaldehyd og farvning med Hoechst, vi udleveret resazurin farvestof i hver brønd (endelig koncentration på 20 μg/mL), og efter en 6 h inkubation, vi målte absorbans (573 nm) med en Pladelæser. Vi kunne også have brugt celle nummer baseret på Hoechst farvning som en udlæsning. Mens ved hjælp af et surrogat reporter for at overvåge virus replikering var unødvendig i dette skærmbillede, en virus med en reporter protein, bestemt en fluorescerende proteiner lette skærmen optimering, som man kan, for eksempel, overvåge virus replikering live; Derudover en virus med en reporter protein er mindre besværlige og bekostelige end af antistoffer til pletten for virale antigener, men det er muligt at skærmen uden en. Derudover kunne man gøre yderligere ændringer i analysen at undersøge vært faktorer, der påvirker på smitteevne, burststørrelse og endnu mere detaljeret sub fænotyper som immunologiske celledød. I hvert tilfælde ville man følge en lignende assay udvikling protokol, screening strategi og sekundære og tertiære validering metoder.

I protokollen foreslår vi optimere Transfektion betingelser ideelt med flere tumor cellelinjer. Der er mindst to grunde for optimering med flere cellelinjer. En af grundene er, at ikke hver cellelinje er indstillet til høj overførselshastighed screening som nogle kan være svært at transfect eller kan ikke holde sig godt, men en vigtig grund er, at screening med flere cellelinjer for at undgå celle iboende bias. Valget af cellelinjer er stort set afhængig af ens målsætninger. Man kan vælge at fokusere på en bestemt kræft type eller vælge forskellige kræft typer til at dække et bredere spektrum. Alternativt kan man ønsker at fokusere på tumor cellelinjer, der er resistente over for identificere vært faktorer, der kan manipuleres til at gøre tumor cellelinjer mindre modstandsdygtige over for oncolytic virusangreb.

Ud over udvælgelsen af celler linjer er udvælgelsen af positive og negative virus kontrol en vigtig overvejelse for enhver skærm. I nogle tilfælde kan virus gener, der er nødvendige eller begrænse replikering kan ikke være kendt, eller hvis de er kendt, de kan være celle-specifikke. Derfor kan en stadig bestemme den omtrentlige robusthed og dynamikområde i analysen ved hjælp af surrogat kontrol. For eksempel kunne man bruge ikke-inficerede celler eller celler inficeret med en lav MOI som en surrogat positiv kontrol for at identificere gener, der sænker spredning på knockdown. For at identificere gener, der øger spredningen på knockdown, kunne man inficere celler med en fortyndingsrække af virus, og brug wells med den maksimale signal som en surrogat positiv kontrol.

Udvalg af hits til sekundær skærm validering og teknologi til at ansætte type er en anden sag, der kræver omhyggelig overvejelse. Kandidater er generelt valgt for sekundær skærm validering baseret på omfanget af hit på hvorvidt de betydeligt modulere spredning i flere kræft cellelinjer (hvis primære skærme blev gennemført i flere cellelinjer) og biologiske interesse. Bioinformatik værktøjer som DAVID22,23, PANTHER24, streng25 og PINdb26 kan bidrage til at isolere veje og hits af biologisk interesse. Mercer et al. 8 beskriver brugen af open source billede analyse software og har ligeledes skabt anvendelig en algoritme, som de udviklet til visualisering og analyse af hits. En faktor at tage i betragtning ved fortolkning af resultater er at genhæmning kan have forskellige påvirkninger afhængigt af fase i virus livscyklus, der er ved at blive undersøgt. For eksempel, det er muligt at knockdown af et gen tidligt i livscyklus kan hæmme virus replikering, mens knockdown på et senere tidspunkt kan øge replikering. Ofte er sekundære skærme udført med siRNA fra en anden leverandør med forskellige frø regioner med flere siRNAs pr. gen. Dog kan komplementære teknologier målretning kandidat gener være ansat som CRISPR-Cas9 eller lentivirus vektorer udtryk for shRNA.

Analysemetoden er også en kritisk overvejelse. Vi foreslår her, ved hjælp af den robuste Z-score eller gal20,27 med foreslog cut-offs til hit kald af > 2 eller < -2. Cut-offs kan forhøjes eller nedsættes afhængigt af om fokus er på at fjerne flere falske positiver eller indfange mere falske negativer. For eksempel, i en nylig høj overførselshastighed skærm med vaccinia virus9, blev den nedre cut-off sat på-1.5 (ingen øvre cut-offs blev beskrevet som var fokus på at identificere gener, der faldt spredning på knockdown). Der er også andre metoder, som kan være ansat, herunder z-score, SSMD (strengt standardiseret gennemsnitlige forskel) og B score20,28,29,30. Barrows et al.31 sammenlignet hit lister genereret af summen rang, MAD, z-score og SSMD og fundet enkelte analysemetode resulterede i forskellige hit lister. I toto, er der ingen perfekt metode eller cut-off. I sidste ende, sekundær skærm validering og tertiær valideringsundersøgelser vil bekræfte sande hits.

Også skal betragtes som metode til at frafiltrere cytotoksiske hits. En måde er at gennemføre primære skærme i parallelle plus eller minus virus. Dette tillader påvisning af siRNAs, der er cytotoksiske på egen hånd. Dette var vores tilgang i vores Maraba virus skærme15; men det er ikke ofte praktiske. Måske er en mere praktisk metode, ud over at være robust, at fastslå hits, der er cytotoksiske, som en del af sekundære skærm validering, især hvis ens fokus er at identificere hits at fald replikering på knockdown. For eksempel, i hele genom primære skærm med myxom virus, Teferi mfl. 11 identificeret 1,588 siRNAs, der faldt virus replikering på knockdown. Hvis du vil filtrere cytotoksiske siRNAs, gennemførte de en sekundær cytotoksicitet skærm med disse siRNAs; de målte celle levedygtighed 72 h efter Transfektion ved hjælp af en resazurin-baseret celle levedygtighed assay. Cytotoksiske siRNAs blev identificeret, baseret på en Z-score på ≤-1.96. En anden metode er at blot bortfiltrere cytotoksiske siRNAs fra den primære screening data baseret på en reduktion af celle nummer af en vis procentdel, for eksempel ved en reduktion af > 50% som Sivan et al. 9, eller baseret på en bestemt score som Lee et al. 14; i deres undersøgelse af vært faktorer kræves for vesikulær stomatitis-virus replikering, udelukkes de siRNA hits, der reducerede cellernes levedygtighed af > 3.0 standardafvigelser fra gennemsnittet. Det gennemsnitlige antal celler var fast besluttet på grundlag af Hoechst farvning af cellekerner, og selvom ikke udtrykkeligt, middelværdien tilsyneladende blev beregnet på grundlag af pr. plade, da det er klart, at betyde normal god landbrugspraksis signal blev beregnet på grundlag af pr. plade.

En begrænsning af enhver høj overførselshastighed RNAi skærm er det hyppige høje antal af falske positiver og negativer, der kan komme som følge af analysen design, den anvendte teknologi eller gennem systematiske fejl. For eksempel, et protein kan påvirke replikering af virus, men det tidspunkt valgt for genhæmning kan være for kort givet det protein half-life til at opdage sin virkning, fører til en falsk negativ i kraft af analysen design. Det er godt etableret, ufuldstændige knockdown og off-target effekter af siRNA teknologi også kan indføre falske positiver og negativer. Systematisk fejl, såsom kanteffekt32, kan generere misvisende resultater så godt. Her kan signal i de ydre pladens huller være systematisk højere eller lavere end resten af pladen som følge af fordampning. Der findes strategier til adresse nogle af disse spørgsmål, herunder f.eks: faldende koncentration af siRNA at reducere off target effekter33, omkonfigurere plade layout for at udfylde de yderste brønde med medierne for at afbøde kant effekten eller beskæftiger beregningsmetoder, der er blevet udviklet for at afsløre og imødegå systematisk fejl som kanteffekt32,34,35. En generel metode til at håndtere falske positiver er at gennemføre en sekundær skærm efter den primære skærm. Som en måde at håndtere falske negativer, kan man slappe af cut-off til hit kald og omfatter potentielle falske negativer for sekundær screening. Dette vil naturligvis ikke fange falske negativer, der er godt under afskæringen. Primære skærme bør også gennemføres i to eller tre eksemplarer at begrænse falske resultater. I sidste ende, ligegyldigt hvad strategier er ansat, ingen høj overførselshastighed skærm vil udtømmende identificere alle sande hits, men det kan give en guldgrube af data, som en er tilbøjelige til min nogle værdifulde hits, der kan kapitaliseres på.

I denne protokol beskrevet vi brugen af klædt siRNA og shRNA teknologi, selvom et andet alternativ er brugen af samlet shRNA og CRISPR-Cas9 biblioteker. Et samlet shRNA bibliotek blev ansat i Workenhe et al. 12 undersøgelse skitseret i indledningen. Poolet CRISPR-Cas9 teknologi har været brugt til at foretage genome-skala skærme for at identificere vært faktorer kræves til replikering af vira såsom Zika virus36, West Nile virus37,38, dengue virus39 og hepatitis C virus39. Fordelen ved at bruge poolede biblioteker er at de er billigere for at købe, ikke kræver specialiseret infrastruktur (f.eks. flydende håndtering af enheder, high-indhold mikroskoper og robot udstyr), heller ikke de har de høje omkostninger ved drift og vedligeholdelse af denne infrastruktur, og de kræver færre forbrugsgoder. Ulempen er, at typerne af udlæsninger er mere begrænset. I de fleste hvis ikke alle poolede bibliotek vært-virus interaktion skærme til dato er udlæsningen cellernes levedygtighed eller mangel på samme; man kan ikke umiddelbart sonde til mere komplekse fænotyper. Valg af format afhænger de biologiske spørgsmål.

Fremskridt i genetisk screening teknologi over de sidste mange årtier at første aktiveret skærme i bakterier og gær til nu nutidens genom-skala skærme i humane celler har åbnet døren bred for opdagelse i forskellige områder af undersøgelsen. Disse genetiske skærme har ikke kun tilladt os at besvare grundlæggende biologi spørgsmål, men har givet os nøgler til oplåsning indsigt i udvikling og forbedring af biotherapeutics. Der er stadig kan lære og udfordringer der skal overvindes med denne teknologi, har resultater til dato været spændende. Opdagelser vil sandsynligvis være endnu større, som romanen screening teknologi, herunder CRISPR-Cas9 biblioteker, mikrofluidik og i vivo screening teknologier fortsætter med at modne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Ontario Institut for kræftforskning, Canada Foundation for Innovation, Ottawa regionale Cancer Foundation og Terry Fox Research Institute. K.J.A. blev støttet af en Vanier Canada Graduate stipendium, canadiske Institut for sundhed Research-Master's Award, og en Ontario Graduate stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
siRNA library GE Dharmacon G-005005-02
Corning 384-well plate Corning 3985
Falcon 384-well plate Becton Dickinson 353962
Water Sigma W4502
siGenome SMARTpool PLK1 GE Dharmacon M-003290-01
AllStars Negative Control siRNA Qiagen SI03650318
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 GE Dharmacon D-001206-14-20
DMEM/HIGH Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30022.01
Fetal Bovine Serum Sigma F15051-500ML
HEPES solution (1M) Sigma H3535-100ML
Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 2500056
DPBS/Modified GE Healthcare Life Sciences SH30028.02
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778100
Oligofectamine Thermo Fisher Scientific 1225011
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 22600-050
Resazurin sodium salt Sigma R7017-5G
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H21492
Formaldehyde (37% by weight) Fisher Scientific F79-4
500 ml bottles Corning 430282
Adhesive Sealing Film For Microplates Excel Scientific 361006007
Peelable Heat Sealing Foil Thermo Fisher Scientific AB-3720
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette Fisher Scientific 11-120-625
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MicroFlo Select (liquid dispenser) Fisher Scientific 11120621
BioTek Synergy HT plate reader Biotek N/A
Opera Imaging and Analysis Instrument PerkinElmer HH10000115
KiNEDx Robotic Arm Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) KX-300-660
Cytomat 24C Series Automated Incubator Thermo Fisher Scientific 50080227
JANUS Automated Workstation PerkinElmer AJI4M01
Plate Carousel Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) N/A
Alps 3000 plate sealer Thermo Fisher Scientific AB-3000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
  2. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
  3. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
  4. Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
  5. Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
  6. Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
  7. Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
  8. Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
  9. Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
  10. Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).
  11. Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
  12. Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
  13. Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
  14. Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
  15. Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
  16. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
  17. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
  18. Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
  19. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
  20. Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  23. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  24. Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
  25. Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
  26. Luc, P. -V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
  27. Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
  28. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  29. Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
  30. Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
  31. Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
  32. Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
  33. Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
  34. Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
  35. Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
  36. Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
  37. Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
  38. Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
  39. Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).

Tags

Kræftforskning spørgsmål 134 Oncolytic virus RNAi skærm høj overførselshastighed kræft vaccinia rhabdovirus celle vært funktionel genomforskning
Genome-wide RNAi Screening at identificere vært faktorer, at modulerer Oncolytic Virus terapi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, … More

Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, S. D., Lefebvre, C. A., Stojdl, D. F. Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy. J. Vis. Exp. (134), e56913, doi:10.3791/56913 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter